近年来，CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展，在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。Cas核酸酶产生的DNA双链断裂(double-stranded break, DSB)主要是通过非同源性末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）在靶点处随机产生一个或几个碱基的缺失和插入，实现基因功能敲除的目的。而通过同源指导修复(homology-directed repair, HDR)机制的基因敲入可以产生确定的基因变化,但效率偏低。另一方面，基于Cas9的碱基编辑器（Base editor， BE）以及先导编辑器（Prime base editor， PE）可以在不产生DSB基础上产生碱基的替换，但是它们只能在短片段DNA（<50nt）以内实现高效替换，另外还存在脱靶效应。因此，提升HDR效率的基因编辑技术亟待出现。

对此，CRISPR诺奖得主Jennifer doudna团队12月2日在PNAS上发表了以“Decorating chromatin for enhanced genome editing using CRISPR-Cas9”为名的研究论文，揭示了染色质修饰状态对基因修复方式产生的影响，并依此开发出了可以提高HDR修复效率的基因编辑工具。与普通Cas9相比，该工具能在基因组中的Cas9切割位点特异性地接触染色质，使HDR效率提高了3倍，HDR：indel比率提高了5倍。而且在多个细胞系中都提高了HDR效率，同时也没有增加脱靶。

由于之前的研究对于染色质特征对DNA修复方式影响的结论并不统一^1–3，所以作者首先评估内源染色质特征对DNA修复方式的影响。借助已公开的H3K36me3和H3K4me3谱图，作者选择了16个具有不同H3K36me3和H3K4me3水平特征的靶位点（图1A），并在ssODN供体模板上设计PAM上游点突变，引入单碱基突变来评估基因组修饰情况。发现富集H3K36me3的位点平均显示出更高的HDR频率以及HDR：indel比（图1 B-C），说明相比于未进行染色质修饰或仅存在H3K4me3， H3K36me3存在会更有利于HDR途径产生。

图1

以此假设改变组蛋白修饰状态可以影响DSB修复方式。为了实现目的，将Cas9分别与3种不同功能的组蛋白甲基转移酶PRDM9、SETD2、 SETMAR结合在组蛋白上沉积H3K36me3或H3K4me3(图2 A-C)。其中PRDM9沉积H3K36me3和H3K4me3调节DSB定位和修复，并且在之前小鼠中的研究表明它不会影响转录⁴。

图2

进一步通过CHIP-qPCR分析这4种融合蛋白是否能够进行特定位点的组蛋白修饰，并将Cas9改为dCas9来消除DSB对组蛋白修饰的潜在影响。在之前的C7位点上，PRDM9-dCas9和PRDM9dC-dCas9使H3K36me3增加了3.2倍，H3K4me3增加了12.7倍；SETD2-dCas9使C7位点的H3K36me3增加了3.3倍，SETMAR-dCas9使H3K36me2比dCas9增加了1.2倍（图3 E）。

图3

接下来作者利用BFP报告系统在HEK293T细胞中评估不同组蛋白甲基转移酶的编辑结果。在ssODN模板上带有三核苷酸变化，如果进行HDR修复，细胞表达GFP（BFP⁻/GFP⁺）；如果进行NHEJ修复，则BFP消失（BFP⁺/GFP^-）。（图4 A-B）

图4

转染7天后进行流式细胞仪分析，与Cas9（9.6±0.5%）相比，PRDM9-Cas9和PRDM9dC-Cas9显着提高了HDR效率（15.6±0.8%和13.9±0.7%）（图5 D）。此外，PRDM9-Cas9的HDR：indel（0.28±0.02）比Cas9（0.14±0.01）高出两倍，PRDM9dC-Cas9的HDR：indel比（0.48±0.01）高出近四倍（图5 E）。与Cas9相比，SETD2-Cas9也提高了HDR效率（11.1±0.2%）和HDR：indel（0.19±0.01）。但是SETMAR-Cas9没有改变HDR效率，可能是由于其低甲基化活性。总之，PRDM9融合蛋白显着改善了HDR介导的DNA修复，同时减少了插入缺失的形成。

图5

最后，作者通过转染HEK293T细胞在内源基因上评估了甲基转移酶融合蛋白对DSB修复方式的影响。PRDM9-Cas9在C7和C9位点都产生了更高的HDR频率，此外与Cas9相比，RDM9-Cas9和SETD2-Cas9将HDR：indel比提高了3倍或更多（图6 A-B）。此外，在没有H3K36me3和H3K4me3或仅使用H3K4me3的额外基因组位点上，HDR修复频率和HDR：indel比有更高的提升。作者还评估七个潜在脱靶位点来分析该工具是否会造成脱靶。结果发现与Cas9相比，PRDM9-Cas9没有导致更高的脱靶编辑（图6 E）。

图6

这些发现表明，PRDM9-Cas9提高了Cas9诱导的DSBs之后的HDR效率和HDR：indel比，特别是在缺乏H3K36me3和H3K4me3的位点以及标有H3K4me3的位点。

为了研究PRDM9-Cas9是否可以提高其他细胞类型的HDR效率，我们在HeLa和U2OS细胞进行测试，发现PRDM9-Cas9在HeLa和U2OS细胞的所有三个靶位点上将HDR：indel比提高了两倍（图7 C-D）。总之，PRDM9-Cas9提高了不同哺乳动物细胞系中多个内源位点相对于插入缺失的HDR频率。

图7

HDR介导的精确基因组编辑在研究和临床应用方面具有巨大的潜力，但HDR效率通常较低，并且在不同的基因组位点和细胞类型中差异很大。本研究报告了一种简单的策略，通过工程化CRISPR-Cas9-甲基转移酶融合蛋白来诱导减数分裂和体细胞DNA修复期间参与HR的组蛋白修饰，从而影响DNA修复途径的选择并提高HDR效率。

参考文献

1.    Schep, R. et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol. Cell 81, 2216-2230.e10 (2021).

2.    Janssen, J. M., Chen, X., Liu, J. & Gonçalves, M. A. F. V. The Chromatin Structure of CRISPR-Cas9 Target DNA Controls the Balance between Mutagenic and Homology-Directed Gene-Editing Events. Mol. Ther. - Nucleic Acids 16, 141–154 (2019).

3.    Kallimasioti-Pazi, E. M. et al. Heterochromatin delays CRISPR-Cas9 mutagenesis but does not influence the outcome of mutagenic DNA repair. PLoS Biol. 16, e2005595 (2018).

4.    Thibault-Sennett, S. et al. Interrogating the Functions of PRDM9 Domains in Meiosis. Genetics 209, 475–487 (2018).