介绍一篇发表在Nature Methods上的文章，题目为A highly stable monomeric red fluorescent protein for advanced microscopy，通讯作者是来自福建医科大学的付志飞和吴淙贤、西湖大学的Kiryl D. Piatkevich以及厦门大学的郑清炳，他们的研究方向主要关注于活细胞的超分辨成像、荧光探针开发以及蛋白质结构研究等领域。

荧光蛋白（FP）的稳定性对于活细胞成像、超分辨率显微镜以及相关光学和电子显微镜等成像技术至关重要。尽管现在已经有稳定的绿色和黄色FP可用，但稳定单体红色FP（RFP）的选择依然有限。在本工作中，作者开发了一种名为mScarlet3-H的极其稳定的单体RFP，对极端条件表现出显著的抵抗力，并具有高信噪比和强特异性。

作者首先基于单体RFP mScarlet进行了结构改造，将原有的164号位Met突变为His，这一突变体显示出更强的光稳定性。尽管在活细胞中亮度不如WT，但进行传统的冷冻电镜(EM)样品制备后，mScarlet-H保留了更多荧光信号。为解释这一结果，作者解析了其晶体结构，发现mScarlet-H的发色团的苯环部分与H164侧链形成了直接的氢键相互作用，这一结合使得其pH稳定性相比于mScarlet有明显提升。基于此结果，作者认为结合mScarlet3和mScarlet-H中的突变会使得蛋白兼具高的稳定性和高亮度，最后得到了mScarlet3-H，尽管亮度低于mScarlet3，但稳定性大大提升。

作者进一步评测了这一蛋白的性质，发现其最大激发波长蓝移至551nm。在稳定性方面， 作者用在光镜-电镜联用技术（CLEM）中常用的锇酸（OsO₄）处理后该蛋白仍保留了65%荧光信号，远超其他的RFPs；用90°C处理1小时后仍保留82.5%荧光，是同类蛋白的2倍以上。该蛋白在8M盐酸胍（GdnHCl）中荧光强度反而增强145%，显示出极强的热稳定性和化学稳定性。这种性质使得mScarlet3-H可以应用于许多极端场景，如在长期3D-SIM成像中，连续2小时拍摄mScarlet3-H几乎无光漂白。另外，mScarlet3-H的高热稳定性为使得高温条件进行全器官成像和组织透明化提供了可能，使得操作时间从1周缩短到1天。

之后作者还测试了mScarlet3-H在CLEM和双色STED上的应用，实现了多种细胞器的高对比度荧光-电镜联用成像和内质网-线粒体相互作用的动态追踪。

总之，本文开发了一种超稳定的单体RFP mScarlet3-H，填补了这一领域的空白，并有望推动超分辨显微成像和动态活体成像的发展。

本文作者：LYC

责任编辑：MB

DOI：10.1038/s41592-025-02676-5

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-025-02676-5