化学法生物素标记的介绍与应用

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对于大部分的实验检测,化学标记法通常就足以满足需求。无论是购买商品化的蛋白,还是实验室表达的特殊蛋白,用简单的化学试剂就能将蛋白标记上生物素,即可用于后续检测。



常用的化学法标记试剂根据其功能不同分为如下几类

1.标记蛋白质氨基的活化生物素:NHS-Biotin和Sulfo-NHS-Biotin;NHS-LC-Biotin and Sulfo-NHS-LC-Biotin;NHS-Iminobiotin

2.标记蛋白质巯基的活化生物素:Biotin -BMCC,Biotin-HPDP ,Iodoacetyl-LC-Biotin  

3.标记蛋白质羰基或羧基的活化生物素:Biotin-Hydrazide and Biotin-LC-Hydrazide ,Biocytin Hydrazide 

4.其他类型活化生物素: Photobiotin ,Biotinyl- L -3-(2-naphthyl)-alanine hydrazide,Biotin-PEG-Phosphine


生物素标记化合物的基本设计如下图所示,所有这些修饰试剂的共同之处在于结构的一端存在双环生物素环,而另一端存在可用于与其他分子偶联的反应基团。

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在选择所需试剂时,不仅需考虑到偶联所用的基团,还需考虑所用试剂的水溶性,并选择合适的溶剂对其进行溶解。此外,当偶联的样品活性受到影响时,可以考虑空间桥联臂的影响,增加间隔臂可以使偶联物更容易接近生物素,与链霉亲和素的相互作用可能会提高5倍。在选择生物素化试剂时,另一个需要考虑的变量是其结合能力,例如与天然生物素相比,亚胺生物素与亲和素结合能力更弱,如果需要再次将两者分离,那么使用亚胺生物素需要的条就更为温和。



下面我们以NHS-Biotin为例,简单介绍一下标记的流程

NHS-Biotin,中文名称:生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(Smart货号SLR00101),分子式:C14H19N3O5S,分子量:341.38,化学结构式如下:

基本的标记步骤为:

1.称取2mg NHS-Biotin,加入590µl DMSO,混合均匀,现配现用。2.将需要活化的抗体溶于1ml 1XPBS中,一般浓度为2mg/ml的抗体加入溶解好的活化试剂26.6µl(可根据样品浓度适当增减),混合均匀,室温孵育30min或4度2h。3.采用脱盐柱脱盐或透析去除未反应的活化试剂。



化学法生物素标记注意事项

1.依据抗原或抗体分子所带可标记基团的种类(氨基或巯基)以及分子的酸碱性,选择相应的活化生物素和反应条件。

2.标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例。

3.为减少空间位阻影响,可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构。

4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,尽量不影响后者的免疫活性。


根据以上对化学法的介绍,我们对两种标记方法的优缺点进行一个比较,大家可以根据实际情况进行选择。

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生物素标签纯化和检测产品:

不论是Avi-tag定点标记生物素技术还是化学法,将抗体或者蛋白标记后,都需要用合适的介质对生物素化的蛋白进行纯化和检测,我们公司将链霉亲和素(Streptavidin)定点偶联于琼脂糖介质或者磁性微球上,形成了下面两款生物微球和一款预装柱产品:

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具体应用包括:

1.生物素化蛋白的纯化

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2. IP/Co-IP

用我们的Streptavidin Beads 6FF或者Streptavidin MagPoly Beads,结合生物素标记技术可以用于免疫沉淀。先将生物素化的抗体与我们的微球结合,然后用结合了抗体的微球去捕获细胞裂解上清中的抗原,洗脱时抗原脱落。

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此外,Streptavidin Beads 6FF或者Streptavidin MagPoly Beads还可以用于纯化生物素化核酸,应用于下游实验,包括制备单链 DNA 模板,分离 RNA 和 DNA 结合蛋白,固定大 DNA 片段,纯化测序产物以及特异性捕获核酸等等。


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