Chem. Sci. 用激动剂标记铱(III)复合物对多巴胺受体的细胞成像

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分享的是一篇发表在Chemical Science上文章,标题为Cell imaging of dopamine receptor using agonist labeling iridium(III) complex,文章的四位通信作者分别为来自香港浸会大学的Ma Dik-Lung(研究领域包括分子建模、发光过渡金属络合物作为生物分子或金属离子的探针、基于结构的药物设计等)和Wai -Jing Kwong、澳门大学的梁重恒教授以及来自湖南大学的谭蔚泓院士


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肺癌是发达国家和发展中国家的主要死因。非小细胞肺癌(N SCLC)是肺癌最常见的亚型,5年生存率小于15%;血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体(VEGFR)介导的血管生成对癌细胞增殖具有重要意义。有报告称,多巴胺2受体(D2R)激动剂能够抑制血管生成。用D2R敲除小鼠模型进行的研究表明,D2R/VEGFR-2串扰可以介导VEGFR-2磷酸化的分子机制。多巴胺受体也是乳腺癌和结肠癌的良好靶点。癌症早期识别是研究的一个高度优先事项,因此生物系统中癌症生物标志物检测方法的开发引起了极大的兴趣。研究表明,受体多巴胺(D1R/D2R)在NCI-H69 NSCLC细胞中的表达较高。以前有许多的探针进行检测多巴胺(D1/D2)受体在这些细胞中的表达,然而这些探针通常受其较短的发光寿命(1-10ns)、自猝灭、光漂白和荧光共振能量转移(FRET)现象的限制。据知,还没有开发出能够识别活细胞中多巴胺受体(D1R和D2R)的金属复合物探针。特别是铱(III)配合物的长发光寿命、大斯托克斯位移、高发光量子产率和高光稳定性使它们成为多巴胺跟踪的优良替代剂。
作者假设多巴胺激动剂与Ir(III)支架结合可以产生有效的针对于多巴胺受体的探针,设计出合成这种探针物质的策略。首先使多巴胺激动剂与N^N配体结合,再在酸性条件下将结合后形成的化合物转化为相对应的甲酯(记作化合物2)。用对甲苯磺酸吡啶在干燥的DCM中保护化合物2,得到化合物3。随后将化合物3经酸性处理后,用LiOH选择性水解,得到相应的酸(4)。然后用标准试剂将化合物4分别与1,10-phenanthrolin-5-amine和1,10-phenanthroline-5-carboxylicacid偶联形成两种配体。
用合成的两种配体与相应的环金属化Ir(III)二聚体进行反应,然后与CH2Cl2/CH3OH进行氯离子交换,合成了如图所示四种配合物。

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将这四种配合物进行纯化后,用核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和MALDI-HRMS进行表征。发现在这四种配合物中,配合物13的光量子产率最高,发光寿命较长(4.61us),配合物11和配合物14的发光寿命也较长,分别为4.36和4.65us。铱(III)配合物11,13和14的长发光寿命可以通过时间分辨光谱区分它们的发光和背景荧光。
为了验证这一假设,作者采用Cm-460或THS作为模型机制干扰物,与铱(III)配合物相比,有机氟通常具有纳秒的发光寿命。在无延迟的激发脉冲后直接记录发光光谱。Cm-460在455nm处有一个强的发射峰,THS在540nm处有一个中等强度的发射峰。因此,复合体13的峰值分别被后缘和cm-460和0.5的重叠发射峰遮挡。与此相反,当激发脉冲后333ns 的延迟时间记录到发光光谱时,Cm-460和THS的短寿命荧光被消除,配合物13的发射更加明显。
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用 MTT(MTTassay)法测定了配合物11-14对人非小细胞肺癌 A549细胞的细胞毒性。结果表明,配合物11-13的 IC50值在100mm 以上,配合物14的 IC50值为70.79 mm。这表明这些配合物对细胞都是相对无毒的,这使得它们适合于细胞染色实验。A549细胞用复合物11-14(30uM)孵育1h,然后用磷酸盐缓冲液洗涤。用激光共聚焦扫描显微镜在488nm 处观察到配合物11、13和14在 A549细胞中有较强的发光(如下图) ,发光强度随配合物浓度的增加而增加。作者推测配合物11、13和14可以与多巴胺受体发生强烈的多巴胺激动相互作用,从而导致细胞发光增强。

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siRNA介导的基因敲除技术常被用来研究特定蛋白质在细胞中的功能。作者在研究中利用siRNA特定地敲除控制多巴胺受体(D1R/D2R)合成的基因,从而降低多巴胺受体(尤其是D2R)的生物表达水平。在此基础上再进行配合物1113的细胞染色实验,两种配合物在细胞内的荧光成像强度均明显减弱,说明1113在细胞内的结合位点就是多巴胺受体。此外,实验表明在多巴胺类似物存在时,配合物在细胞内的荧光成像强度也明显减弱,说明1113与多巴胺类似物间存在竞争,进一步证明了配合物与多巴胺受体的特异性结合。


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配合物13具有格外优越的荧光分辨度,为确保它能作为荧光分子探针在细胞中发挥持续作用,作者以活细胞荧光染色剂DAPI作为参比,测试了13在细胞中的光稳定性。实验结果表示,配合物13具有相当高的光稳定性,可以做分子示踪的荧光标记探针。
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随后,作者将配合物13应用于A549肺癌细胞中多巴胺受体的示踪研究。四组实验中13与细胞的作用时间依次为0, 10min, 30min, 60min, 180min。荧光成像结果表明,13与多巴胺受体发生特异性结合,可以应用于示踪多巴胺受体的内化作用。

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荧光寿命成像技术(FLIM)与双光子激光扫描显微镜联用,可以将长荧光寿命的配合物13从细胞内的背景干扰荧光中很好地区分出来,得到清晰的荧光成像,指示多巴胺受体的位置分布情况。

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综上,作者合成了带有多巴胺或3-(3,4-二羟基苯基)丙酸作为多巴胺激动剂的四个铱(III)配合物(11-14)。其中,配合物11和13在活细胞中表现出优异的光物理特性和较高的稳定性,且可以选择性地与活细胞中的多巴胺受体(D1R/D2R)结合。另外,光稳定复合物13也可用于监测多巴胺受体(D1R/D2R)在活细胞中的内化过程,它在长寿命发光成像中的应用中,即使在内源性荧光背景信号的存在下,也被证明使用FLIM。作者设想这些复合物可以作为开发多巴胺受体细胞荧光成像探针的有用支架。



本文作者:LWJ、LWQ、LXQ
原文链接:
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2018/SC/C7SC04798C#!divAbstract


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