介绍一篇2019年发表在NCB上的文章，题目为“Mapping spatial transcriptome with light activated proximity-dependent RNA labeling”。本文的通讯作者是北京大学的邹鹏，专注于发展化学探针技术，为神经生物学研究提供新工具，新方法。 
邹鹏老师课题组的工作主要集中在以下3个方面：1.高时空分辨成像观测神经活动；2.时空分辨光催化生物分子的标记；3.时空分辨酶催化生物分子的标记。本文是主要阐述时空分辨光激活的RNA分子标记，除此之外，邹鹏老师也用类似的方法实现了对DNA以及蛋白质组氨酸的标记（RinID，待发表）。
真核细胞中，RNA可以分离到特定的细胞质区室中，实现局部蛋白质合成，除此之外，RNA还可以发挥调节或结构作用。例如，核非编码RNA可以与染色质相互作用以调节基因转录，维持染色质构象或参与无膜细胞器的形成。最近，Alice Ting课题组结合APEX与RIP来研究细胞核、线粒体基质、ER膜和细胞-细胞界面的亚细胞转录组。但是，APEX-RIP表现出较差的空间分辨率，可能是由于APEX标记期间甲醛处理和蛋白质扩散的原因。在这项研究中，作者报告了一种邻近依赖性RNA标记方法CAP-seq。蓝光下，mini-SOG释放单线态氧氧化鸟苷，将胺基探针标记到RNA上。首先，作者优化了光敏剂，通过LC-MS确定了鸟苷加合物的形成。接着，作者测试一组生物素偶联胺探针，包括烷基胺（Btn-NH2）， 苯胺 （Btn-An） 和烷氧基胺 （Btn-ONH2），通过dot blot确定烷基胺是最活泼的探针。最后，为了提高探针的膜通透性，作者用末端炔烃代替了生物素部分作为功能手柄。在光氧化偶联和RNA提取之后，通过点击化学引入生物素。或者光氧化偶联后固定，通过点击反应引入荧光基团。
2.CAP-seq揭示线粒体基质中的转录组以及内质网膜ERM的分泌组mRNA接下来，作者转向测试活细胞中线粒体基质miniSOG介导的RNA标记的空间分辨率和灵敏度。反应在20分钟后终止，细胞固定用于成像分析或裂解以提取RNA含量。作者发现线粒体RNA高度富集。与RT-qPCR结果一致，没有一个胞质RNA被大量富集。局部蛋白质翻译-分泌最初是在ERM发生的。因此，作者期望富集编码分泌组的mRNA。于是作者稳定表达靶向ERM的miniSOG，标记富集分析，产生了377个RNA 列表，其中372个mRNA（99%），GO分析这些mRNA主要编码分泌途径蛋白。基于GOCC与HPA两个数据库发现，372个mRNA有358个编码分泌途径蛋白mRNAs（96.2%）。综上所述，上述数据表明CAP-seq方法能够以邻近依赖性方式标记亚细胞转录组。图2. CAP-seq揭示线粒体基质中的转录组以及内质网膜ERM的分泌组mRNA作者进一步研究了线粒体外膜的转录组，发现110个mRNA（27%）编码线粒体蛋白。作为参考，整个人类基因组中MitoCarta基因仅占4.5%。这些mRNA中有近一半编码线粒体内膜（IMM）蛋白，说明线粒体内膜蛋白在膜外翻译后直接转运进入线粒体。此外还有33个氧化磷酸化相关蛋白质。对于剩余的301个富集mRNA，36个编码核糖体蛋白大亚基，26个小亚基的mRNA，说明线粒体功能可能与蛋白质翻译调节有关。作者通过RT-qPCR和RNA FISH成像验证了OMM CAP-seq数据集中的高富集mRNA。RT-qPCR分析表明，核编码的线粒体mRNA NDUFB9在OMM CAP-seq中富集了5.1倍，相对于胞质标志物GAPDH富集了7.9倍。同样，编码大（RPL23A和RPL37A）和小（RPS9和RPS21）核糖体亚基蛋白质的mRNA相对于GAPDH富集了1.8至4.8倍。我们继续通过RNA FISH验证核编码的OXPHOS mRNA（COX6 A1和NDUFB9）和核糖体蛋白编码的mRNA RPL37A集中在线粒体外膜。MTCO1是一种线粒体基因组编码的mRNA，是阳性标志物。ACTB是一种胞质mRNA标志物。XIST是一种核定位的lncRNA标记。可能存在两种机制来解释RNA的线粒体靶向：RNA可以主动和直接地与OMM上的RNA结合蛋白结合，或者在蛋白质翻译过程中以核糖体/mRNA/新生肽三元复合物的形式被动靶向。为了区分这些机制，作者采用了蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）来稳定三元复合物，他们用CHX处理HEK293T细胞，OMM-CAP-seq注意到核编码的线粒体mRNA富集水平增高。他们推断，CHX可能会通过减缓核糖体的回收来导致核糖体介导的RNA靶向OMM的积累。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-019-0368-5原文引用：https://doi.org/10.1038/s41589-019-0368-5
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