Caspase-4作为炎症性caspase家族的核心成员，在人类固有免疫防御系统中扮演关键调控角色。该蛋白酶通过特异性识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）启动非经典炎症信号通路，进而介导Gasdermin D（GSDMD）的切割，驱动细胞焦亡（pyroptosis）及炎症因子风暴。然而，受限于酶-底物相互作用的瞬时性及低效切割特性，传统基于酶切产物富集的研究策略难以全面解析其底物网络，严重制约了对焦亡信号通路的深入理解。

针对这一技术瓶颈，清华大学尹航教授团队开创性地整合基因密码子扩展技术与光交联蛋白质组学策略，构建了一种创新的底物捕获系统。研究团队基于Caspase-4与GSDMD的相互作用界面，通过精准分子设计实现了三重技术创新：1）在底物结合关键位点（K356）定点插入光敏非天然氨基酸pBpa，构建光交联探针CASP4(C258A)-3C-pBpa；2）通过C258A催化结构域突变消除蛋白酶自剪切活性，防止底物降解；3）引入HRV-3C蛋白酶切割位点维持蛋白天然构象。该探针系统突破性地解决了传统方法中底物捕获效率低、假阳性率高的技术难题。

研究团队首先通过高分辨质谱等技术对光交联探针进行分子表征，确认其分子量及结构完整性。底物切割实验与蛋白质互作分析表明，催化位点失活突变及蛋白酶切位点的插入未破坏Caspase-4的天然构象与功能特性。体外交联实验显示，紫外激活的探针可高效捕获已知底物GSDMD，并能系统性富集裂解液中的互作蛋白，其底物捕获能力显著优于传统方法。

基于Label-Free定量蛋白质组学分析，研究者从THP-1细胞裂解液中筛选出156个候选底物。通过体外切割实验验证，包括AKT1、CASP5/12在内的16种蛋白被证实为Caspase-4的新型底物。这些发现不仅验证了探针技术的可靠性，更为解析焦亡通路中酶-底物互作特异性及信号网络交叉调控提供了关键线索。

本研究在细胞焦亡机制方面也有新的发现：Caspase-4通过特异性切割AKT1蛋白的D108位点，移除其PH结构域的自抑制模块，从而释放活性激酶。这一发现首次揭示细胞焦亡通路可通过AKT信号网络与细胞代谢、存活调控等进程产生跨通路对话。更引人注目的是，研究证实Caspase-4对Caspase-5/12前体具有直接激活作用，揭示了炎症性caspase家族成员间存在级联放大机制，为先天免疫应答的时空调控提供了全新理论框架。

本项研究通过原创性技术开发与系统性功能验证，不仅建立了高效解析蛋白酶底物谱系的通用研究范式，更通过多维度机制解析推动了细胞焦亡领域的研究边界，为感染性疾病和炎症相关疾病的治疗靶点发现奠定了重要理论基础。

A Site-Specific Photo-Crosslinking Proteomics Approach Provides Insights into Noncanonical Pyroptotic Caspase-4 Substrates

Yi Zhou, Xinyu Zhang, Hang Yin

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202501535