分享一篇发表在Nat. Chem. Biol.上的文章，题目为“TOPO-seq reveals DNA topology-induced off-target activity by Cas9 and base editors”，通讯作者是武汉大学中南医院的张楹教授，她们课题组主要的研究方向为通过CRISPR技术直接修复胞内致病突变，或增强免疫细胞抗肿瘤功能来治疗癌症。

CRISPR-Cas基因组编辑工具是革命性的技术，在基础研究和转化医学中具有广泛的应用，检测脱靶事件的发生对于确保该技术的安全性至关重要。目前检查脱靶的方法主要关注于gRNA的错配，但是DNA的拓扑结构也会影响前间隔序列邻近基序（PAM）与Cas9之间的相互作用，从而影响Cas9的切割活性。于是本文作者开发了一种新的方法名为topology-related site identification and sequencing，即TOPO-seq技术来检测DNA拓扑结构造成的Cas9和碱基编辑器的脱靶。

TOPO-seq主要包括两步，分别是体外“筛选”和体内“验证”。体外“筛选”步骤与CHANGE-seq技术相似，但是作者为了构建拓扑结构不同的DNA库，用溴化乙锭（EB）处理了环状DNA库，在EB的作用下，环状DNA超螺旋程度显著增加，可以通过调整EB剂量精确控制超螺旋密度。之后作者将三种不同拓扑异构体的环状DNA文库与Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物孵育，被Cas9切割的DNA随后与测序接头连接，并通过二代测序（NGS）确定切割位点。通过体外实验，作者可以找到对DNA拓扑结构敏感/不敏感的位点。在体内“验证”步骤中，体外“筛选”得到的脱靶位点在经过基因编辑的目标细胞或者组织中通过多重PCR扩增子测序进行验证，以确定真正的脱靶位点。

作者在TRAC_site_2和TRAC_site_3这两个研究得较多的gRNA中验证了TOPO-seq的可行性。作者将该方法应用于造血干细胞中3个治疗性gRNA的脱靶效应研究中，发现了47个脱靶基因座，其中6个是DNA拓扑结构引起的。此外作者还发现DNA拓扑结构会影响Cas9对间隔区错配的容忍度，超过50%的脱靶位点包含6个错配。

作者将该方法应用于造血干细胞中3个治疗性gRNA的脱靶效应研究中，发现了47个脱靶基因座，其中6个是DNA拓扑结构引起的。此外作者还发现DNA拓扑结构会影响Cas9对间隔区错配的容忍度，超过50%的脱靶位点包含6个错配。

综上所述，作者开发了一种名为TOPO-seq的方法，可以研究DNA拓扑结构导致的Cas9和碱基编辑器的脱靶。

本文作者：LZ

责任编辑：MB

DOI：10.1038/s41589-025-01867-7

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-01867-7