分享一篇发表在Chem. Sci.上的文章，文章题目为“Affinity peptide ligands: new tools for chasing non-canonical N-phosphoproteome”，本文通讯作者为中国科学院大连化学物理所的江波副研究员和卿光焱研究员，前者研究方向主要为蛋白组学样品预处理材料和方法，后者主要从事生物分离材料、智能聚合物与界面方面的研究。

可逆的蛋白质磷酸化是研究最为广泛的翻译后修饰（PTM）之一，几乎参与所有的生命过程。磷酸化会发生在蛋白的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸上，发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上的O-磷酸化由于其卓越的稳定性，成为研究的重点。随着研究的深入，由于N-磷酸化也在生命过程中起着非常重要的作用，该修饰引起了越来越多的关注。但是N-磷酸化形成的N-P键在酸性条件下不稳定，所以目前开发的富集磷酸肽的方法均存在各自的缺点。因此，本文作者提出用肽配体来富集磷酸化的肽段，可以一定程度克服之前开发方法的缺陷，为磷酸化蛋白质组的研究提供新的选择。

作者使用噬菌体展示技术来筛选对磷酸基团有较高亲和力的多肽，实验组是将噬菌体展示的多肽库与N-磷酸化肽段pHFF进行孵育，为了消除选择性地与肽骨架结合的肽配体，作者设置了非磷酸化的HFF肽进行阴性筛选。通过噬菌体展示，作者成功找到了4条与磷酸基团表现出较高亲和力的多肽配体，使用ELISA选出与pHFF亲和力最强的P-1配体。ITC测定了P-1与磷酸化肽段TSpHYSIMAR之间的亲和力，解离常数为8.5 M.

之后作者将P-1配体偶联到琼脂糖磁珠表面，得到用于蛋白质组样品制备过程中富集磷酸肽的磁珠，将磷酸肽以一定比例掺入蛋白质组样品中，该磁珠可以有效地从样品中富集到磷酸肽。

之后，作者将该磁珠用于不同模型中蛋白质组磷酸化的分析中。在HeLa细胞中，鉴定出 1995个新的N-磷酸化位点，与以前的方法相比，检测深度大幅增加2至5倍，并显著扩大了N-磷酸化蛋白质组数据库的规模。此外，还发现N-磷酸化修饰高度集中在细胞核中。结合细胞核分离技术，首次鉴定了细胞核中1296个N-磷酸化位点，为揭示核蛋白中 N-磷酸化的功能提供了新的线索。最后，结合定量蛋白质组学方法，研究了阿尔茨海默病进展过程中N-磷酸化修饰的动态变化，为AD发病机制的研究提供了新的视角。

总而言之，本文作者利用噬菌体展示技术，筛选得到一个对磷酸基团有较高亲和力的多肽配体，可用于磷酸化蛋白质组的富集。

本文作者：LZ

责任编辑：MB

DOI：10.1039/D5SC01557J

原文链接：https://doi.org/10.1039/D5SC01557J