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供稿：郝莹，武汉大学
校稿：闵奕豪，郭霞，袁必锋，武汉大学
推送：郭霞，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Chemical Science上，标题为Transcriptome-wide Profiling of N6-Methyladenosine via a Selective Chemical Labeling Method，通讯作者是来自武汉大学化学与分子科学学院的周翔教授。 N6-甲基腺苷(m6A)是最典型的RNA修饰，在基本生物过程中不可缺少。本文提出了一种通过三个化学反应步骤（氧化、还原和功能标记）的化学下拉法(m6A-ORL-Seq，图1)，用于m6A转录组全谱分析。 图1 一种在转录组中选择性标记和定位m6A的化学方法 1. 核苷水平的化学标记 作者选择一氧化氮(NO)水溶液将m6A在温和条件下转化为N-亚硝胺(Nm6A)。而NO在有氧条件下也具有使其他碱基的脱氨基能力，其将腺苷(A)转化为肌苷(I)，将鸟苷(G)转化为黄嘌呤核苷(X)，将胞嘧啶(C)转化为尿苷(U)。经条件优化后，m6A向Nm6A的转化率为88%，A向I的转化率为31%，G向X的转化率为56%，C向U的转化率为9.8%(图2A)。人转录组中的其他修饰也以相同方式检测到了脱氨反应；5-甲基胞苷(m5C)转化为m5U，N7-甲基鸟苷(m7G)转化为m7X。接着，作者筛选出绿色还原剂二氧化硫脲(TDO)，其在Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中将Nm6A还原为N6-氨基m6A (Am6A，图2B)和m6A。随后，使用2-吡啶甲醛测试与Am6A的反应性，Am6A在没有任何催化剂的情况下在水中转化为腙。因此，本文通过化学合成得到带有二硫键的生物素化芳基醛(探针BA，图2C)作为功能性探针，并且通过生物正交腙连接反应用生物素分子(Bm6A)定量标记Am6A。 图2 （A）NO/O2孵育下A/m6A/G/C核苷的HPLC分析；（B）在TDO还原下，Nm6A核苷转化为m6A和Am6A；（C）探针BA的化学结构 2. 测试这种化学方法用于RNA标记的可行性 首先合成仅含有U和m6A的12 nt RNA寡核苷酸(12 nt-m6A)。通过优化，确定12 nt-m6A通过NO鼓泡进入酸性缓冲溶液，定量转化为Nm6A修饰的寡核苷酸(12 nt-Nm6A )。在加热和碱性条件下，通过TDO还原将1 nmol的12 nt-Nm6A转化为12 nt-Am6A，产率为46%。HPLC纯化后，几乎90%纯化的12 nt-Nm6A转化为用探针BA标记的生物素化产物(12 nt-Bm6A )(图3A)。同时，作者应用这种化学方法标记了另一种含有A/U/G/C/m6A的15 nt RNA oligo(15 nt-m6A)。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析表明，几乎50%的15 nt-m6A转化为生物素化的产物(图3B)。接着，对用m6A修饰的60 nt模型RNA进行m6A-ORL分析。斑点印迹试验证明了模型RNA中m6A的选择性生物素化(图3C)。同时，将标记的模型RNA与酵母tRNA混合，并进行下拉程序。之后，对富集的RNA进行RNA-Seq(图1B)。在SuperScript III介导的逆转录(RT)下，标记的m6A被读作A(图3D)，并且观察到A到G (6.8%)的主要突变，因为已知I在RT期间被读作G。斑点印迹试验进一步证实m6A-ORL能够选择性标记HEK-293T总RNA中含m6A的RNA。这些结果表明m6A-ORL有希望用于m6A的转录组分析。 图3 （A）12 nt RNA寡核苷酸测试结果表；（B）15 nt RNA寡核苷酸的变性PAGE分析；（C）斑点杂交分析证实了MALAT1-2577-m6A中m6A的选择性生物素化；（D）m6A ORL Seq程序后模型RNA序列（MALAT1-2577-m6A）的基序 3. m6A-ORL-seq揭示了HEK-293T中转录组范围的m6A甲基体 接下来，对HEK-293T中的m6A进行了m6A-ORL转录组范围的分析。分析spike-in RNA的计数证实m6A-ORL能够富集m6A片段。在人转录组中鉴定出相当数量的m6A峰，其典型基序为DRACH(图4B)。通过miCLIP确认的m6A (MALAT1，ACTB)和m6A-REF-Seq的两个显著区域也通过m6A-ORL-Seq检测到(图4A)。平均归一化读数在m6A峰中心附近高度特异性分布，进一步验证m6A-ORL可以低背景富集m6A片段(图4C)。饼图显示了五个非重叠转录片段中每一个片段的m6A峰值分数，结果与之前报道的m6A分布一致(图4D)。此外，还对m6A-ORL-Seq和MeRIP-Seq进行了比较分析。观察发现m6A-ORL峰的总富集倍数高于MeRIP，近50%的m6A-ORL峰与MeRIP重叠，m6A峰分布相似(图4E和4F)。这些结果表明，本方法具有与MeRIP相同的可靠性水平。50%与MeRIP不重叠的峰的metagene图谱显示在5' UTR和3' UTR区域富集，显示出MeRIP无法检测到的可能的N6,2 '-O-二甲基腺苷(m6Am)和m6A位点(图4H)。检测出显著的m6A和m6Am基序(BCA，B = G/U/C)(图4I)。这些结果进一步表明，测序数据包含人m6A甲基的完整信息，噪声几乎为零。与报道的源自m6Am-Seq的m6Am峰相比，24%的报道位点与这些独特峰重叠(图4J)。进一步的碱基分辨率分析证实，在m6A-ORL的独特峰中存在相当多的m6A和m6Am位点。总体而言，m6A-ORL比MeRIP具有更高的分辨率(图4G)。 图4 m6A ORL序列揭示了HEK-293T中转录组宽m6A甲基体 4. m6A-ORL以单碱基分辨率检测m6A位点 在模型RNA上的m6A-ORL-Seq数据分析中，观察到RT截短的特异性标记，以单碱基分辨率标记m6A位点(图5A)。因此，推测N6位氢供体(被大体积基团取代)的缺失导致RT截短(图5B)。随后，作者合成了几个含有N6修饰腺苷的15 nt RNA寡核苷酸，以验证这一假设。使用SuperScript III (SS III，广泛用于RNA-Seq文库构建)和M-MuLV逆转录酶进行RT反应(图5C)。变性PAGE显示，遇到A或m6A时RT反应平稳延长，而遇到m6A衍生物(m6,6A，Bm6A，Tm6A)时在12 nt时终止。基于RT截短，设定了终止率(> 10%)和截短读数(> 4)的严格阈值以获得高置信度。然后对DRACH基序进行m6A-ORL峰扫描，识别出4001个终止于A的位点。为减少假阳性，参照相同阈值检测输入样本中m6A峰的区域，筛选出18个假阳性位点。假阳性率低(0.4%)表明终止位点的特异性高。筛选出的3983个位点被认为是由m6A-ORL-Seq识别的高置信度m6A位点。通过m6A-ORL-Seq揭示了GGACG基序中A处的显著截短(图5D)。 图5 m6A-ORL产生特定的RT截断 将m6A-ORL-Seq鉴定的m6A位点与m6A-label-Seq位点、m6A-SAC-Seq位点和m6A-SEAL-Seq峰进行了比较(图6)。结果表明，m6A-ORL-Seq和m6A-SAC-Seq保持较高的一致性(图6A)。大多数(77%)m6A-ORL-序列位点位于m6A-SEAL-序列峰(图6B)。为了进一步评估这些位点的准确性，采用不同的碱基分离度方法对之前报道的位点进行了全面比较。比较结果确定，除DART-Seq外，m6A-ORL法鉴定的m6A位点重叠率最高，这表明m6A-ORL-Seq法检测的m6A位点重复性和可信度最高。这些结果证明了m6A-ORL-Seq对于m6A的转录组范围检测是高度可靠的。 图5 不同化学辅助方法确定的m6A数据集之间的重叠程度 5. m6A-ORL可以检测甲基化水平低的m6A位点 测序数据中的spike-in RNA计数表明m6A-ORL-Seq可以选择性地富集低甲基化水平低的m6A片段。为了进一步证实参考了包含m6A化学计量信息的报道数据。MAZTER-Seq提供了一种可行的m6A定量分析方法，在HEK-293T转录组中鉴定并相对定量了约80000个m6A位点。因此，从每种方法的数据集中提取鉴定出的m6ACA位点，并与MAZTER-Seq的数据集进行比对。然后，将775个miCLIP-CIMS位点(27%)、214个miCLIP-CITS位点(18%)、1742个DART-Seq位点(22%)、783个m6A-REF-Seq位点(18%)、46个m6A-label-Seq位点(8%)和148个m6A-ORL-Seq位点(27%)映射到MAZTER-Seq数据集。化学计量分布显示，通过miCLIP-CIMS和DART-Seq鉴定的大多数位点均为低水平甲基化，这与全局m6A甲基化水平的分布一致。miCLIP-CITS和m6A-REF-Seq检测到的位点甲基化水平分布相对平均。考虑到化学标记的内在特征，m6A-label-Seq和m6A-ORL-Seq容易检测到高甲基化水平的m6A。然而，m6A-label-Seq在低甲基化检测中没有优势，而m6A-ORL-Seq仍然提供了相当多的低甲基化水平的m6A位点(20%的鉴定位点在低于20%的水平上甲基化)。m6A-SAC-Seq是一种最近报道的方法，也可以测量m6A甲基化水平。1043个m6A-ORL-Seq位点(26.2%)被映射到m6A-SAC-Seq数据集，其中52%的鉴定位点在低于20%的水平上甲基化。这些结果证实，这种化学下拉策略能够在低甲基化水平下富集和检测m6A位点。 6. 总结 本研究报道了一种新的用于m6A转录组全谱分析的化学下拉方法，这个方法可以以碱基分辨率进一步检测高置信度m6A位点。m6A-ORL为转录组水平的m6A检测提供了新的视角，它将有助于对RNA甲基化的进一步研究。 文章编号：100 原文链接： https://doi.org/10.1039/D2SC03181G 原文引用： Yalun Xie#, Shaoqing Han#, Qiming Li, Zhentian Fang, Wei Yang, Qi Wei, Yafen Wang, Yu Zhou, Xiaocheng Weng, Xiang Zhou*. Transcriptome-wide Profiling of N6-Methyladenosine via a Selective Chemical Labeling Method. Chem Sci, 2022, DOI:10.1039/D2SC03181G. (#为共同第一作者)
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