Anal. Chem.|基于二甲基化标记中a1碎片离子的相对定量策略

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分享Analytical Chemistry上的一篇文章,题目为A1 Ions: Peptide-Specific and Intensity-Enhanced Fragment Ions for Accurate and Multiplexed Proteome Quantitation,文章通讯作者为中国科学院大连化学物理研究所的张玉奎院士。张玉奎院士课题组主要发展针对蛋白质的高效分离与高灵敏度检测技术。


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蛋白质组的准确相对定量可以提供不同实验条件下蛋白质丰度变化的重要信息,是后续各种研究的开展具有重要指导意义。目前,基于稳定同位素标记的的定量方法,如SILAC、二甲基化标记等使用前体离子定量的技术,以及TMT、iTRAQ等使用报告离子定量的技术,均能实现对多重样品的同时定量。但上述技术也存在线性区间窄、受背景、干扰肽段影响等问题。

在这里,研究人员注意到,串级质谱中由b1离子中性丢失CO产生的a1离子,在二甲基化标记后,由于二甲基取代亚铵离子能够稳定N上的电荷,该碎片离子的强度发生了显著增强,同时,a1离子的质量数取决于肽段N端氨基酸,表现出一定的肽段特异性。基于以上观察,研究人员计划建立一种基于二甲基化标记中a1碎片离子的相对定量策略。


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作者首先对二甲基化标记对a1离子生成的影响进行探究。二甲基化标记后,99%肽段匹配的二级谱图中,均可以观察到a1离子的生成,表现出较高的生成效率。同时,a1离子的生成效率,对于不同N端氨基酸基本不表现出差异性。从离子强度的角度,在二甲基化标记后,a1离子与b、y离子总强度的比例提高至2.34倍。


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接下来,研究人员对肽段进行轻重标之间质量差异为5.84 mDa的二甲基化标记,建立基于串级质谱中a1离子的相对定量方法,并与传统的基于前体离子的二甲基化定量技术进行比较。结果表明,本文建立的方法,具有更高的定量覆盖度,同时,在提高样品间比例后,仍能保持较低的相对误差和变异系数,呈现出较好的定量准确性和精密性。

对于肽段定量中广泛出现的共碎裂肽段,以及其对定量结果造成干扰的问题,基于a1离子的肽段特异性,研究人员将新方法的定量结果与TMT标记的结果进行对比。研究人员在对大肠杆菌蛋白质组进行二甲基化标记后,分别按照1:5、1:10两种比例混合,同时,向其中掺入人类蛋白质组作为干扰肽段,建立了分析模型。在加入干扰样品后,两种混合比例的定量中位数发生少量偏移,但均在10左右,显著优于此前报道的TMT定量结果。TMT定量受共碎裂肽段影响,在1:10混合时,定量中位数已被扭曲至3.2。将每个肽段在干扰前后的定量结果进行绘制,同样可以观察到本文的定量技术具有更高的一致性与抗干扰能力。


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最终,研究人员通过对N端氨基、C端赖氨酸分别进行二甲基化标记,发展出基于a1离子的8重定量技术,并将其应用于TGF-β诱导的表皮上皮转化(EMT)过程研究中,揭示了上述过程中蛋白表达量的变化。


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综上,本篇工作基于a1碎片离子进行相对定量,相比传统二甲基定量技术与TMT定量技术,建立了准确度更高的8重相对定量技术。

 

本文作者:TZS
责任编辑:MYZ
文章链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c00876
原文引用:DOI:10.1021/acs.analchem.2c00876


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