Anal. Chem. | 基于BODIPY的荧光探针分析胞内脂质自由基结构

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分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章:Structural Analysis of Intracellular Lipid Radicals by LC/MS/MS Using a BODIPY-Based Profluorescent Nitroxide Probe,通讯作者是日本九州大学的Ken-ichi Yamada教授。

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    自由基介导的脂质过氧化(LPO)是多种疾病中的关键反应。为更好地研究LPO的作用机制,识别脂质自由基的结构至关重要。已报道的荧光探针NBD-Pen(Anal. Chem. 2020, 92, 10, 6993–7002)虽然成功检测到源自5种多不饱和脂肪酸(PUFA)的132个脂质自由基,但HRMS/MS缺少来自脂质自由基的碎片信息,所以只能确定脂质自由基的种类,并不清楚其结构。为了确定脂质自由基的结构,关键是获得其碎片信息。

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    作者在探针NBD-Pen基础上开发了BDP-Pen探针。为研究NBD-Pen化学结构和脂质自由基碎片信息之间的关系,作者通过LC/MS/MS对比了NBD-labeled的荧光探针(NBD-Pen和NBD-TEMPO)与OH-labled的非荧光探针(OH-Pen和OH-TEMPO)检测花生四烯酸过氧化产物(AA+O)的差别。结果发现,与NBD-labeled的探针相比,OH-labeled的探针可以检测到来自AA+O的碎片离子。作者推测NBD荧光基团限制了AA+O的碎裂,于是将NBD替换为其它几种荧光基团,其中阳离子荧光团Dansyl、NileBlue和RhoB在正、负离子模式下均无AA+O的碎片信息,电中性荧光团Naph和BODIP(BDP)在负离子模式下观察到了AA+O碎片。这可能是由于Naph和BDP呈电中性,促进电荷转移到AA+O使其碎裂。考虑到BDP光化学性质和生物利用率优于Naph,作者选择了BDP-Pen探针用于后续研究。

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接着,作者用BDP-Pen探针鉴别了3种HpETE异构体(15-HpETE、12-HpETE和5-HpETE)衍生的AA+O自由基。在金属离子的存在下,HpETE发生Fenton反应分解成AA+O异构体。虽然三者都存在m/z 189.5413(AA+O)的一级质谱峰,但二级质谱的碎片信息有所差异,存在特征峰,可以此区分AA+O异构体,从而确定HpETE。

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最后,作者用BDP-Pen探针对细胞中AA衍生的自由基进行了检测和结构分析。向HT1080细胞中添加AA和BDP-Pen孵育,利用LC/MRM进行高灵敏度和高通量分析,作者检测到了15种脂质自由基,进一步结构分析还发现了上述3种HpETE衍生的AA+O异构体。此外,作者还建立了三者的BDP-Pen+AA+O标准曲线,实现了加合物的半定量分析,有助于评估脂质自由基的生物活性。
综上,作者开发了BDP-Pen荧光探针,可用于检测AA处理的HT1080细胞中AA+O自由基异构体,有望成为阐明生物系统中LPO机制的有力工具。
本文作者:ZRJ
责任编辑:MB
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c04950
文章引用:10.1021/acs.analchem.2c04950


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