分享一篇发表在Science Advances上的文章，题目为“Affinity selection–mass spectrometry with linearizable macrocyclic peptide libraries”，本文通讯作者为MIT的Bradley L. Pentelute教授。Pentelute课题组的研究方向涉及蛋白质合成、修饰、递送以及配体筛选等多个领域。

与小分子相比，多肽在靶向蛋白-蛋白相互作用这一方面具有优势。多肽大环化可以进一步提高多肽的蛋白水解稳定性、细胞渗透性、结合亲和力和口服生物利用度。因此，大环化合物库是基于亲和选择的多肽配体发现平台的首选。尽管大环肽具有潜力，但用于配体发现和开发的大型大环肽文库的合成方法一直很有限。基于基因编码的环肽文库往往具有较高的复杂度（>108个成员），但受限于转录-翻译机制，仅能利用天然氨基酸；基于化学合成的环肽文库可以极大地拓展氨基酸残基的化学空间，但文库大小较为局限（<108个成员）。

本文中，研究人员制备了一个含有天然和非天然氨基酸的大型环肽文库，具有1亿条序列。大环的形成是通过一个简单的二硫键完成的，通过在水溶液中使用碘单质氧化迅速完成。通过埃尔曼测定法对环化和线性化形式中的游离硫醇含量进行定量，证实了硫醇在库中完全转化为二硫化物，而SEC显示二硫键完全是在分子内形成的，没有发生寡聚。事实证明，二硫键与非天然的含硫醇残基兼容，同时也不会增加文库合成和制备的额外步骤。在用于亲和选择后，用二硫苏糖醇处理可实现近定量还原，生成线性肽类似物，用于标准串联质谱分析。

作者将这些包含天然和非天然氨基酸的大环高多样性文库应用于基于MS的亲和选择平台，以实现肽配体的新发现。12ca5蛋白可结合含有D**DY(A/S)序列的肽，作者用它来测试并额外验证高分辨率大环文库的使用。

第二个靶标CDH2参与神经和心脏代谢功能中细胞的基本生物粘附。在第一轮筛选中，研究人员得到的CBP肽显示出与CDH2的浓度依赖性结合、结合特异性和高亲和力，Kd值分别为50 nM。在研究了CBP的SAR后，发现几个热点残基对与CDH2的结合至关重要，其中包括几个疏水和阳离子残基。

根据 SAR 研究结果，作者又合成了两个包含多种非天然氨基酸的大环化合物库，分别侧重于亲和力驱动热点和非必要冷点。随后作者进行了亲和力选择实验并研究了热点是否可以进一步细化，或者冷点是否可以在重点库设计成熟后对结合亲和力做出有意义的贡献。总的来说，使用热点CDH2聚焦文库的AS-MS没有提供任何结合剂，也没有对原始CBP肽进行改进。不过，使用冷点文库进行的AS-MS实验能够提供几个经单独验证为高亲和力结合体的候选肽。在这些候选肽中，NCBP-4的高亲和力（Kd ~ 29 nM）、特异性和特异侧链贡献得到了更仔细的研究，这些都是由取代原始CBP冷斑残基的氨基酸所证明的。

综上所述，本文建立了一种构建可线性化的大规模环肽文库的方法，并成功将其用于nM水平蛋白配体的筛选与发现。

本文作者：TZS

责任编辑：MB

DOI：10.1126/sciadv.adr1018

原文链接：https://doi.org/10.1126/sciadv.adr1018