分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Multiplicity of Regulatory Subunit Conformations Defines Structural Ensemble of Reset Protein Kinase A Holoenzyme。文章的通讯作者为宾夕法尼亚州州立大学的Ganesh S. Anand教授，其研究方向为使用质谱工具揭示细胞大分子组装的动态过程。

众所周知，蛋白激酶A（PKA）全酶由2个催化亚基（C）和2个调节亚基（R）组成，在非激活状态下，R亚基的假底物序列结合C亚基的催化位点；而当R亚基的两个cAMP结合结构域（CNB-A/B）与cAMP结合时，R亚基发生变构而从C亚基解离，从而使PKA的激酶活性被激活。但被cAMP变构的R亚基如何被重置（reset），如何与C亚基重新结合的过程尚不完全清楚。目前的证据表明与PKA共同锚定在A-激酶锚定蛋白（AKAPs）上的磷酸二酯酶（PDEs）对cAMP的水解参与了PKA-R的重置，但这一过程中蛋白结构的动态变化仍是未知的。本文中，作者使用冷冻电镜（cryo-EM）、负染电镜（nsEM）、非变性质谱（native MS）、氢氘交换质谱（HDXMS）和交联质谱（XLMS）等工具详细表征了PDE8介导PKA全酶重置过程中的构象景观。

首先，作者通过native MS确定了PDE8是PKA重置所必须的：与cAMP饱和结合的PKA-RIα无法再与PKA-Cα复合，而经PDE8孵育后，方可观察到全酶的重新形成，这一重置过程部分依赖于ATP。

随后，作者使用cryo-EM和HDXMS解析了重置后PKA全酶的结构，结果显示重置的PKA全酶为高度动态的异源四聚体，其中RIα的CNB-A与Cα形成稳定界面（结合ATP），而CNB-B因高度无序而未观测到密度。HDXMS证实cAMP从CNB-A/B完全释放。进一步的结构分析发现CNB-B存在三种空间构象（间隔40Å至14°角变化），其动态性由连接CNB-A/B的αB/C螺旋的断裂驱动，且HDXMS显示CNB-B释放cAMP后特定区域氢键保护增强。此外，HDXMS和XLMS揭示了RIα的N端无序连接区（I63-D119）的动态特征，其中的假底物序列被结合的Cα很好地稳定。而C端连接区（111-123）结构则为高度动态的。负染电镜显示全酶颗粒呈哑铃状，链间距分布广泛（160-320Å），体现了链间的高度柔性。

最后，作者想要时间分辨地监测PDE8将cAMP水解成5’AMP、介导PKA全酶形成的动态过程。作者使用脉冲标记 HDXMS 分析监测从 RIα释放的cAMP，在4 min的时间尺度上逐分钟采样。结果表明当PDE8单独作用于PKA-RIα时，结合的cAMP水解速率较慢（与游离cAMP相比慢8倍）。而有趣的是，在PKA-Cα存在下，结合cAMP的水解速率提高约130倍，全酶的重置可在1分钟内完成。上述结果揭示了PKA的重置是通过Cα辅助的PDE8协同机制实现的，其中Cα加速cAMP解离，PDE8完成水解以驱动全酶形成。

总之，本文报道了PDE8介导的PKA-RIα上结合的cAMP的降解和PKA全酶的重置，并使用了多种工具详细地表征了PKA全酶重置过程中的构象景观，包括CNB-A处的稳定界面、CNB-B的构象多样性和连接区的动态等。作者也初步探究了PKA-Cα辅助cAMP解离和水解的机制。

本文作者：TYC

责任编辑：MB

DOI：10.1021/jacs.4c16269

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c16269