推荐一篇发表在JACS上的文章，题目为“Holdup Multiplex Assay for High-Throughput Measurement of Protein–Ligand Affinity Constants Using a Mass Spectrometry Readout”，通讯作者是来自斯特拉斯堡大学的Elodie Monsellier，Gilles Travé以及Christine Carapito。他们课题组的研究方向分别为病毒蛋白质与相互作用网络和定量蛋白质组。

蛋白-蛋白相互作用是细胞功能的核心，这种相互作用的典型案例是14-3-3蛋白与磷酸肽的相互作用，作者此前开发了Holdup分析，可以高精度量化PPI的平衡结合力，在此本文作者通过开发基于无标定量质谱的策略将其扩展为Holdup Multiplex，用于在单个实验中量化数千个蛋白-配体相互作用的亲和力。

这一方法的原理是，通过将n个不同目标配体的文库与树脂连接的诱饵多肽一起孵育，待相互作用至平衡后，未结合的配体被过滤掉，将其与空对照流出的配体进行定量质谱分析，即可对相互作用的解离常数进行相对定量。

作者使用七种14-3-3蛋白来评估Holdup Multiplex的性能，首先他们设计了一个生物学相关的潜在14-3-3蛋白结合基序库，然后使用PhosphoSitePlus筛选了在体内可以被有效磷酸化的序列，得到了1032个磷酸肽段文库。然后量化了1032中磷酸肽与7中14-3-3蛋白的相互作用，从而定量了文库中73%的磷酸肽段。作者从中鉴定了313个新的结合基序，分布于99个不同蛋白质中，其中包含CDC25B这些经典的14-3-3蛋白的结合基序。另外，7种14-3-3蛋白没有特异性结合的肽段，且其对磷酸肽的亲和力始终遵循如下顺序：γ>β>η>ζ>τ>ε≈σ，但也有小部分的肽段例外，如HDAC7上的pSer358为中心的磷酸肽对所有14-3-3都有相似的亲和力。同时作者还注意到14-3-3蛋白的结合肽段上普遍具有在磷酸化+2位置富集Proline的特征。

最后作者还讨论了使用Holdup Multiplex评估梭球菌素-A（Fusicoccin-A，FCA）影响14-3-3/磷酸肽复合物稳定性的潜力，结果表明有135种磷酸肽与14-3-3γ/σ的相互作用受到FCA的影响，这一结果也展现了Holdup Multiplex在评估化合物对于PPI影响方面的潜力。

总之，本文发展了一种用于评估PPI的多重定量质谱方法，可以被广泛运用于多种复杂体系种的PPI相对定量和化合物筛选。

本文作者：LYC

责任编辑：MB

DOI：10.1021/jacs.4c11102

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c11102