分享一篇近期发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，题为：Dual-Action-Only PROTACs。该文章的通讯作者为来自马萨诸塞大学阿默斯特分校的S. Thayumanavan。

    PROTAC等靶向蛋白降解剂能够彻底消除目标蛋白，提高药效，降低耐药性，但也存在脱靶毒性和选择性不足的问题。刺激响应型PROTAC，即在被靶细胞的特异性刺激激活之前不发挥作用的PROTAC有望解决此问题。但目前的报道主要集中在单一刺激激活型PROTAC。

    在本文中，作者提出了一种新型的DAO-PROTAC，需要两种正交的疾病特异性刺激同时存在才能被激活，在提高药物特异性的同时降低脱靶毒性。

    作者首先选择与肿瘤相关的低氧环境和组织蛋白酶L (Cath-L)作为双刺激因素,以靶向BRD4的PROTAC—dBET1作为模型。选择dBET1是因为在dBET1的结构中存在两个酰胺键，为掩蔽单元的引入提供了反应位点，引入后仲酰胺变为叔酰胺，不易水解，提高口服生物利用度，且在Linker上进行修饰比在配体上修饰更具有通用性。具体来说，dBET1是由BET抑制剂JQ1、Linker和E3 蛋白连接酶配体Thalidomide组成，作者利用4-硝基苯甲基掩蔽JQ1部分实现低氧环境响应性激活，利用ε-乙酰化N-Boc-赖氨酸掩蔽Thalidomide部分实现Cath-L响应性激活。只有两种刺激同时存在，DAO-dBET1才会转化为活性形式，启动蛋白降解。如图1所示。

图1. DAO-dBET1的结构及双刺激响应机制

    作者接下来在MDA-MB-231细胞中利用CoCl₂诱导类缺氧环境对DAO- dBET1的功能进行了验证，结果显示DAO-dBET1在两种触发条件均存在下对BRD4的降解效力(DC₅₀=277 nM)、毒性(IC₅₀=281 nM)以及诱导细胞凋亡的能力与未修饰的dBET1(DC₅₀=158 nM，IC₅₀=167 nM)相当，而在不添加CoCl₂并用Z-FY-CHO抑制Cath-L时，BRD4降解极少，验证了两种正交响应性刺激控制的有效性。值得注意的是，单一刺激存在时虽未显著降解BRD4，但仍导致33%和31%的细胞凋亡，推测是JQ1或Thalidomide部分释放引发下游效应。如图2所示。

图2. 不同刺激下DAO-dBET1对BRD4的降解效果

    作者又合成了单一刺激激活的Hyp-dBET1和Cath-L-dBET1，在对应刺激下表现出与dBET1相当的BRD4降解能力和细胞毒性。但WB实验发现单一刺激激活的PROTAC在无对应触发条件时仍可调控下游蛋白，表现出浓度依赖性。表明DAO-dBET1相较于Hyp-dBET1和Cath-L-dBET1显著降低了脱靶效应，提高特异性与安全性。如图3所示。

图3. Hyp-dBET1和Cath-L-dBET1对BRD4的降解效果

    作者又在Cath-L低表达的健康肾细胞HEK-293中评估了DAO-dBET1的安全性。结果显示，此时DAO-dBET1无法有效降解BRD4，但在缺氧条件下，DAO-dBET1仍具有一定的细胞毒性，这是因为缺氧刺激触发JQ1脱落，而在双正交刺激激活机制下，因Cath-L低表达而无法触发完整的PROTAC功能，显著降低了对非靶标蛋白的影响。

图4. 健康细胞中DAO-dBET1对BRD4的降解效果

    为了验证此策略的通用性，作者又合成了靶向细胞周期蛋白依赖性激酶9 (CDK9)的DAO-THAL-SNS-032。在缺氧和Cath-L同时刺激下，DAO-THAL-SNS-032可有效降解CDK9, DC₅₀与IC₅₀与未修饰的THAL-SNS-032活性相近。而在缺乏任一刺激时，CDK9几乎不被降解，但仍有一定的细胞毒性，可能是单独释放的SNS-032或Thalidomide引发的下游效应。

图5. 不同刺激下DAO-THAL-SNS-032对CDK9的降解效果

    综上所述，本文提出了一种新型正交双重刺激激活的PROTAC，仅在低氧和组织蛋白酶L两种肿瘤微环境信号共存时才能激活蛋白降解功能，活性与未修饰的PROTAC相当，且单刺激条件下仅释放配体引发有限毒性，提升PROTAC的靶向特异性并降低脱靶毒性，为开发新的蛋白降解疗法提供了重要范式。

作者：YXM 

DOI: 10.1021/jacs.5c00131

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.5c00131