Sci. Adv.|基于D-型氨基酸代谢标记策略在体研究肠道细菌的生长分裂模式

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为大家介绍一篇本课题组最近发表在Science Advances的文章,题目为 “Revealing the in vivo growth and division patterns of mouse gut bacteria。本工作基于D-型氨基酸荧光探针在体序贯代谢标记(STAMP)FISH技术相结合的策略,成功对小鼠复杂肠道群落中特定种属细菌的原位生长分裂模式进行研究,为揭开肠道暗物质的神秘面纱提供了首个可行的在体研究方法

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近年来,众多的研究揭示了肠道菌群与宿主疾病的发生发展息息相关。随着新一代测序技术的发展,越来越多的肠道细菌新种被鉴定出来,极大地丰富了肠道微生物组数据库。但由于培养组学发展的限制,目前仍有大量的肠道细菌在实验室中是不可培养的,这些微生物被形象地称为肠道暗物质,这也严重限制了科学家进一步深入研究肠道菌群的生理、病理功能以及其与宿主的相互作用。此外,对于能够在实验室中培养的肠道细菌,在体外研究中获取的微生物学知识能否真实反映其在宿主体内的生物学行为,目前也存在一定的争议。因而,亟需开发能够在体原位地研究肠道微生物的新方法

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1. FDAA序贯代谢标记结合FISH染色示意图

基于上述原因,本课题组开发了基于我们前期提出的D-型氨基酸荧光探针(FDAA)序贯代谢标记策略(STAMP)与荧光原位杂交(FISH)技术相结合的新方法(示意图见图1A),实现了对肠道内多种细菌种属(包括不可培养细菌)在体原位的生长分裂模式的探究。由于FDAA探针能够代谢掺入细菌细胞壁的肽聚糖结构,作者通过先后分别使用带有TAMRA Cy5荧光团标记的FDAA 探针(TADACy5ADA)灌胃对小鼠的肠道菌群进行在体的序贯代谢标记,获得带有两种颜色标记的肠道菌群(图1B,C),并且两种颜色在细胞壁上的分布可以反映细菌在代谢标记这段时间中的生长分裂情况(新生成的细胞壁区域会有更强的第二种FDAA荧光信号)。之后,分别使用不同细菌种属相对应的FISH探针,便可借助FISH信号进一步明确感兴趣的各种属细菌的生长分裂模式。

32. Genus分类水平的肠道细菌在体的生长分裂模式

作者首先通过16S rDNA和宏基因组测序分析了FDAA双色标记的肠道菌群组成,选择了15种优势细菌属进行生长分裂方式的探索,成功观察到13种肠道细菌属6种革兰氏阴性和7种革兰氏阳性菌属,图2和图3A在体的生长分裂情况,每个属都呈现了各自独特的生长分裂模式。与革兰氏阳性菌迥然不同的是,革兰氏阴性菌多为1-2 μm的短棒状细菌且FDAA荧光信号较弱(图2G-H),甚至有两种革兰氏阴性菌(HelicobacterDesulfovibrio)无法被标记上FDAA荧光信号。此外,由于某些细菌种属尚无报道可用的FISH 探针序列,本课题组利用经过优化后的FISH探针序列算法,在不同的系统分类水平上设计了相应的FISH序列,并对探针的特异性进行了多方面验证。

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3. 梭菌属在体的生长分裂方式具有多样性

作者在属分类水平上研究生长分裂模式时发现,梭菌属表现出了多种生长分裂模式(图3A)。因而,作者针对其中3species设计了相应的FISH序列,结合FDAA序贯标记的成像信息,观察到不同species的梭菌(包括不可培养的Clostridium ASF502)呈现出不同的生长分裂方式(图3B),这也验证了这一策略在species分类水平上研究肠道细菌的可行性。基于此,作者继续在species水平上探究了其他物种的生长分裂模式(图4),包括3种无法在体外单独培养的肠道细菌(Oscillibacter sp. 1-3Eubacterium sp. 14-2Dorea sp. 5-2.)。

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4. Species分类水平的肠道细菌在体的生长分裂模式

值得注意的是,作者还观察到分节丝状菌(Segmented filamentous bacteria, SFB)在体原位的生长分裂情况。基于FDAA序贯代谢标记提供的荧光成像信息,作者成功观察到SFB的多种超微结构,如SFB定殖于肠上皮细胞的关键部位holdfast结构,以及细菌分化过程进行不对称分裂时形成的三个septum聚集结构等。并且,FDAA两种颜色在SFB细胞壁上不同的分布模式,揭示了在整个标记过程中SFB各分段可能分别处于不同的生长发育阶段。SFB在许多免疫机制中都发挥重要的作用,已成为肠道菌群中研究最广泛的细菌之一,但是SFB需要依赖于其他共生体提供必需的营养物质,无法在体外被单独培养。近五十年来,人们大都通过革兰氏染色和电镜技术来研究SFB的形态结构表型,而本课题组开发的这一研究策略,无需进行复杂的纯化分离培养过程,即可实现在体原位研究肠道中SFB的生物学行为,为进一步研究SFB在肠道中发挥的生理和病理功能提供了新方法。

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5. SFB的生长分裂模式

综上所述,作者开发了基于FDAA在体序贯代谢标记与FISH技术相结合的研究新策略,可用于直接探测小鼠肠道菌群中多种细菌在体原位的生长分裂模式,也为进一步探究目前我们所知甚少的肠道暗物质在体内的生物学行为提供了新的方法。该研究策略有望继续用于探索其他复杂的微生物群落。

 
撰稿人: Liyuan Lin
编辑:Juan Gao
原文链接: https://advances.sciencemag.org/content/6/36/eabb2531


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