5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶（5mC）去甲基化的关键中间产物，近年来受到越来越多的关注，被称为是“第六碱基”。由于5hmC在脑、乳腺、肝、肺、肾等肿瘤中相比对应的正常器官普遍下调，被认为是多种癌症早期诊断的潜在生物标志物。因此，定量分析5hmC对于早期癌症诊断具有显著的临床意义。目前，LC-MS/MS技术及重亚硫酸盐测序是5hmC检测的主要方法。然而，由于哺乳动物体内5hmC丰度非常低（通常不到胞嘧啶的1%），而且重亚硫酸盐处理会导致DNA的降解，使得5hmC的准确检测需要较大的进样量，限制了这些方法在定量稀有临床样品中5hmC的应用。近期，中山大学生物医学工程学院的戴宗教授和中山大学附属第七医院的许宇智老师报道了一种高灵敏的5hmC荧光检测方法，在基因组DNA（约1000个细胞的提取量）仅有5 ng的条件下，准确地测定了不同小鼠组织、人细胞系（包括乳腺癌、肺癌和肝癌细胞及对应正常细胞）、健康人及膀胱癌患者的尿液中整体5hmC水平。此外，本方法可以在仅有100个细胞样本的条件下实现正常细胞和癌细胞的区分。相关成果以“Highly Sensitive Fluorescence Detection of Global 5‑Hydroxymethylcytosine from Nanogram Input with Strongly Emitting Copper Nanotags”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.1c03266）。作者提出了一种基于末端转移酶（TdT）辅助形成的强荧光Cu纳米标记的高效荧光方法hmC-TACN，用于5纳克基因组DNA中整体5hmC的定量。图一概述了hmC-TACN的原理和步骤。（1）基因组DNA片段的封闭。用TdT和二脱氧胸腺嘧啶核苷酸（ddTTP）封闭DNA片段的3’端，以避免在样品DNA末端发生TdT催化的非特异性延伸，从而使TdT能全部作用于5hmC位点上修饰的primer。（2）糖基化反应。随后，基因组DNA中的5hmC被T4噬菌体β葡萄糖基转移酶（T4-βGT）和尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖（UDP-N3-Glu）标记上叠氮葡萄糖基团，形成N3-5gmC。（3）Click反应。带有炔基的随机引物DBCO-primer，通过Click反应共价连接到叠氮修饰的5hmC位点。详细的分子机理见图一B。（4）信号放大。TdT沿着修饰在5hmC上的随机引物开始无模板延伸，生成长的poly T尾，其可作为生成荧光CuNPs的模板。最终，含有大量的强荧光CuNPs标签可以被标记到5hmC位点上，从而在不需要复杂的引物设计和热循环的情况下，达到PCR级别的5hmC信号放大。本方法非常灵敏，无需重亚硫酸盐处理，无需MS仪器，也无需PCR设备，操作简单，可以从仅5 ng的基因组DNA中进行整体5hmC定量。此外，甚至在只有100个细胞提取的DNA情况下，通过增加TdT延长时间并加大dTTP的用量，实现正常细胞和癌细胞的区分（图二）。与其他单分子荧光标记方法相比，本方法通过普通荧光仪器实现低样本量中5hmC的准确定量，操作简单且成本低，具有很好的临床应用前景。
图一（A）hmC-TACN法荧光检测5hmC示意图：（1）基因组DNA片段封闭；（2）糖基化反应；（3）Click反应；（4）信号放大。（B）随机引物修饰5hmC的分子机理。（来源：Anal. Chem.）
图二 在标准步骤或改变反应条件下，hmC-TACN方法对于100个HepG2和WRL68细胞基因组中5hmC的荧光强度响应（来源：Anal. Chem.）
荧光hmC-TACN策略直接扩增5hmC位点，实现5 ng（~1000个细胞）的低DNA进样量。而且在更高的反应物浓度及延长的反应时间下，hmC-TACN方法可以在普通仪器上实现对100个细胞基因组DNA中5hmC整体水平进行定量。在包括组织、细胞和尿液样本中，成功量化了整体5hmC水平，与正常样本相比，癌症样本中5hmC水平显著下降。这些研究证明了hmC-TACN在有限样本下促进基于5hmC的癌症或其他疾病的非侵袭性诊断的潜力，并为肿瘤模型的微区分析提供了一种潜在的检测手段。
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