课题组开发一种响应型RNA聚合酶元件与电化学耦合用于MMP-2免标记检测的方法

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引言

随着人工生物系统的标准化和模块化创建可编程功能,合成生物学为构建生物传感器提供了大量靶标分子功能识别元件。近几十年来,虽然基于这些功能元件的全细胞合成生物学在生物传感器领域取得了巨大的进展。但需要一个细胞宿主,将会导致该生物传感器存在传质障碍、细胞毒性、遗传不稳定性等方面的局限性。为了克服这些局限性,无细胞合成生物传感策略以其具有简单、快速、自由度高等优点受到研究者们的广泛关注。在目前报道的无细胞合成生物传感器中,荧光法和比色法是主要的信号输出方式,但它们往往存在灵敏度不够或需要精密仪器的问题。最近,研究者将无细胞合成生物元件与电化学耦合用于核酸的检测(2020. Nat. Chem. 12, 48-552020. Angew. Chem. Int. Ed. 59, 20545-20541)。这些研究不仅为无细胞合成生物传感器在信号输出面临的挑战提供了一种可行的解决策略,而且为无细胞合成生物学与电化学界面的合理耦合树立了典范。尽管这一进展意义重大,但用于检测非核酸生物标志物的无细胞电化学生物传感器尚不成熟。因此,急需将无细胞电化学生物传感器的应用范围扩展到对非核酸靶标的高敏感和强特异性检测。



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成果简介

基于先前课题组构建的蛋白酶响应型RNA聚合酶(PR)元件(2020. Chem. Sci. 11, 2993-2998),作者将该元件与电化学界面进行耦合,构建了一种免标记的电化学生物传感器,实现对靶标蛋白酶生物标志物的检测(图1)。以肿瘤标志物MMP-2为例,当靶标MMP-2存在时,MMP-2每次水解PRMMP-2的肽链都会产生一个有活性的T7 RNAP。在转录模板和核糖核苷三磷酸的帮助下,活性的T7 RNAP可以通过体外转录合成大量可编程的转录RNA。作者通过合理的序列设计,合成转录的RNA由2个部分组成,其中包括:富含鸟嘌呤序列和能够与固定在金电极上的捕获DNA探针(CP)的互补序列组成。当将靶标蛋白水解触发的转录产物滴在电极上时,转录的RNA被固定在金电极上的CP探针捕获,随后在含K+的缓冲溶液中形成G-四链体-血红素(Hemin)复合物。通过测量Hemin直接电子转移的信号,从而实现免标记放大电化学检测靶标MMP-2。该方法为未来构建蛋白酶相关疾病的临床诊断策略提供有益的思路。该研究成果以“Amplified and label-free electrochemical detection of a protease biomarker by integrating proteolysis-triggered transcription”为题发表在Biosensors and Bioelectronics上(Biosensors and Bioelectronics 190 (2021) 113372),文章第一作者为博士生史铠,通讯作者为雷春阳副教授。

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1 PR元件与电化学耦合实现免标记蛋白酶检测的示意图。


作者对该电化学蛋白酶传感器的灵敏度和进行探索。随着MMP-2浓度从10 fM增加到1.0 nM,差示脉冲伏安法(DPV)峰值电流从0.25 -1.88 μA(图2A)。如图2B所示,在10 fM-1.0 nM范围内,DPV电流信号与MMP-2浓度的对数呈线性关系(R2=0.9943),线性回归方程为i=4.6621+0.3139 lg C,其中σ是空白试验的相对标准偏差(n=11)。根据3σ法则,评估该传感器的检出限为7.1 fM。除了高灵敏度外,良好的特异性也是蛋白酶生物标志物临床诊断的重要的指标。考虑到在复杂的细胞微环境中可能会发生许多蛋白水解反应,需要采用其他细胞蛋白酶,对该传感器带来的潜在影响进行评估。因此,为了研究基于PR构建的电化学生物传感器检测MMP-2的特异性,作者选择了凝血酶、呋喃蛋白酶和其他类型的MMP蛋白酶(MMP-3、MMP-8和MMP-9)作为潜在的干扰物。如图2C所示,在靶标蛋白酶MMP-2存在的情况下,产生的DPV电流信号与空白对照组(无靶标MMP-2时产生的背景信号)相比显著的增加。而其他蛋白酶,即使浓度为靶标MMP-2浓度的5倍,却只能产生微弱的电流信号,这表明基于PR的电化学生物传感器对MMP-2的检测具有很强的特异性。


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图2(A)传感器对不同浓度MMP-2的DPV响应曲线。(B)DPV电流信号与不同浓度靶标MMP-2的校准曲线。(C)传感器对MMP-2和其他蛋白酶的DPV电流信号。 


基于PR构建的免标记电化学生物传感器具有较高的灵敏度和特异性,作者进一步评价了其在复杂生物样品中检测MMP-2活性的实用性以及潜质应用价值(图3A)。根据先前的文献报道,MMP-2的活性在人类癌细胞和各种人类癌症组织中表达上调(2009. J. Clin. Oncol. 27, 5287-5297)。为此,以HepG2为例,LO2为对照,分离富集其细胞培养上清,随后传感器进行分析。如图3B所示,作者在LO2细胞组仅观察到微弱的DPV信号。相反,在HepG2细胞组观察到强烈的DPV电流信号,通过计算,该数值是LO2细胞组的2.9倍,这可能与MMP-2在肿瘤细胞过表达相关。当HepG2细胞经MMP-2抑制剂(ARP 100)预处理后,DPV信号下降到空白组水平,说明观察到的DPV信号是MMP-2特异性催化的蛋白切割反应产生的。随后,作者对从6例患者骨肉瘤(OS)和癌旁组织(PC)中提取的粗蛋白直接进行检测。如图3C所示:与PC组织相比,OS组织中MMP-2活性产生的DPV信号更强。上述电流强度证明在OS组织中的MMP-2活性大于PC组织中MMP-2的活性。此外,在PC组和OS组中,经ARP 100预处理过的样品导致DPV信号急剧下降,表明MMP-2在这些组织中的活性较高。综上所述,这些结果表明,该电化学生物传感器在分析临床样本中靶标蛋白酶具有巨大的潜力。


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图3(A)传感器检测复杂样本中的MMP-2的示意图。(B)不同细胞分泌上清中MMP-2的DPV信号响应。(C)6例OS患者的OS和PC组织标本中MMP-2表达水平检测的DPV信号响应。


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总结与展望

综上所述,作者开发了一种基于PR的免标记和高灵敏检测靶标蛋白酶电化学生物传感器。由于有效整合了体外转录介导的信号放大和电化学检测技术自身的高灵敏度,该传感器实现了对靶标MMP-2生物标志物飞摩尔灵敏度的特异性检测。通过对生物样品中MMP-2水平的活性有效地评估,进一步证明了该生物传感器在基础生物医学研究和临床疾病诊断方面具有潜在的应用前景。通过调整靶标位点可以方便地构建具有不同目标响应性的PRs,只需简单地替换PR模块,即可制备用于检测其他蛋白酶生物标记物的电化学生物传感器。因此,该研究为无细胞合成生物学策略与电化学界面的整合提供了一种可行的范式,未来将推动其更先进整合的研究,从而开发出更强大、更适用于临床诊断的方法。



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原文链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566321004097?via%3Dihub






编辑:史铠

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