今天带来nature biotechnology上的一篇文章，Reimagining high-throughput profiling of reactive cysteines for cell-based screening of large electrophile libraries，文章通讯作者是来自哈佛医学院的Steven P. Gygi. 他的研究主要关注在质谱和蛋白质组学领域开发和应用新技术。

      在复杂的生物体系中分析氨基酸侧链的反应性对于药物开发具有重要意义，而通过化学蛋白质组学技术鉴定半胱氨酸反应性亲电片段是非常有效的策略，其中isoTOP-ABPP技术已经成为这一领域的标准，即通过使用碘乙酰胺探针标记半胱氨酸，进而通过点击化学反应进行富集，再通过同位素标记的可切割标签进行质谱分析和定量。这一方法目前最大通量是成功地用于在细胞裂解中分析>50个亲电小分子片段。尽管该方法取得了很大成效，但它需要大量的起始样品蛋白（每个小分子需要500μg）和大量的仪器时间，难以实现高通量的鉴定。

      本文作者在isoTOP-ABPP基础上，开发了一个更优化的策略，即SLC-ABPP（streamlined cysteine-activity-based protein profiling），该方法是通过结合新脱硫生物素碘乙酰胺探针和TMT技术，实现高通量筛选半胱氨酸反应性片段库，增加样品多重性到10或者15，并且尽可能减少筛选每个片段所需的仪器时间和样本量，例如降低初始样品量5-20倍；同时作者结合实时搜索智能数据采集（RTS）技术和新的富集实验操作，将筛选每个亲电片段的质谱时间缩短了42倍，并且提高定量精度。作者证明了该策略在筛选大型化合物库方面的实用性，通过在三个基因不同的细胞系中，在每个细胞系总仪器时间<6天的情况下，重复分析285个小分子片段。本方法是迄今为止，实现最大规模的、基于质谱的半胱氨酸反应性小分子片段筛选研究

       作者发展了SLC-ABPP策略后，首先对该策略进行评估测试。作者使用三种已知的半胱氨酸反应性共价抑制剂分子在多个浓度下进行了鉴定，包括KRAS抑制剂ARS-1620、CDK7抑制剂THZ1和BTK抑制剂ibrutinib。作者三次重复实验，鉴定到大于8000个位点，并且各自的靶点肽段都分别是最显著的，同时具有浓度依赖的，说明该策略的有效性；接下来作者就用该策略在含有285个氯乙酰胺和丙烯酰胺类结构片段的小分子库上进行了筛选，在48孔板上分别用小分子处理活细胞，然后收取细胞进行实验，通过三次重复一共定量到6,145蛋白上的23,364 位点，其中1134个蛋白质被至少一个亲电片段修饰，62%的修饰位点库中的单一亲电片段显著结合。作者还有其他的一些发现，其中一些蛋白例如ACAT1，它的126位半胱氨酸可以被化合物特异性CL95修饰, 而413位可以CL74化合物高选择性修饰，所以可以将二者通过linker连接后实现对ACAT1酶活的抑制，为药物发现提供先导化合物；除了筛选用到的细胞系HCT116 以外，作者还在另外两种细胞系HEK293T and PaTu-8988T中进行了285中化合物的标记筛选并且进行了一系列分析。作者还发现化合物66和67对MGMT的145 位半胱氨酸修饰从而抑制酶活等；作者还对特定蛋白进行了构效分析，例如在三种细胞系中都鉴定到的SRC蛋白280位半胱氨酸，被化合CL126修饰和环砜结构对PIN1蛋白上的C113修饰等。作者通过酶活、WB等实验验证了其修饰对于酶活的影响。

       总之，作者改进了多重化学蛋白质组学，用以高通量筛选亲电小分子片段，并在微摩尔浓度分子处理的细胞中鉴定了约6000个蛋白质的综合反应性半胱氨酸图谱，和285个独特亲电小分子的标记位点信息。这些研究为未来针对酶活性位点的探针设计提供信息。并且极大扩大了研究技术的通量。

本文作者：ZYL

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-020-00778-3

原文引用：DOI：10.1038/s41587-020-00778-3

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