Chem.Sci.|光氧化驱动的邻近标记策略用以分析活细胞中的线粒体蛋白质组动力学

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分享一篇发表在Chemical Science上的文章,文章标题“A photo-oxidation driven proximity labeling strategy enables profiling of mitochondrial proteome dynamics in living cells”,文章的通讯作者是来自大连化物所的张丽华研究员和江波副研究员。

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研究背景

真核细胞由不同的亚细胞结构组成,包括细胞器、囊泡和大的蛋白质组装体,它们依靠不同的蛋白质组成来执行特定的生物功能。阐明亚细胞蛋白质组的时空动态特性对于更好地理解各种生物过程至关重要,因为蛋白质的定位和表达水平随着环境的变化而变化,所以它们在生理和病理状态下的功能也会随之变化。此外,细胞信号网络的精确调控依赖于特定空间和时间内蛋白质的改变,如蛋白质复合物的组装和降解、转录因子在细胞质和细胞核中的易位以及在细胞应激下蛋白质的重新分配。因此,描述细胞器和其他结构的亚细胞蛋白质组动力学是非常有必要的。

线粒体作为细胞的动力源,在蛋白质组学中被研究最多,因为它们在许多影响健康和疾病的关键过程中起着至关重要的作用,如Ca2+稳态、炎症和细胞应激反应。传统的线粒体蛋白质组学研究方法是通过密度梯度离心法获取线粒体,但存在时间长、纯度低、覆盖范围小等缺点。近年来,具有高特异性和高时空分辨率的原位蛋白质化学标记技术的出现为线粒体蛋白质组学分析提供了一个有效的工具。基于工程酶(如APEX和TurboID)的邻近标记会产生活性中间体,可以用于标记、解析线粒体甚至亚线粒体蛋白质组,这对于发现线粒体的新成分和确定未知蛋白质的亚细胞定位具有重要意义。但是,这需要基因操作来构建工程酶,不适合难以转染的敏感、复杂的组织或细胞样本。基于细胞器可定位反应分子(ORM)的化学蛋白质组学技术,在不进行基因转染的情况下,在特定亚细胞区室中标记蛋白质,因此被发展用于各种细胞器的蛋白质组学研究,如细胞核、内质网和线粒体。但是,存在反应时间长、低时空分辨率以及通过其他亚细胞结构时会产生额外的假阳性标记等缺点。因此,仍然需要发现一种新的化学蛋白质组学策略用于研究线粒体蛋白质组。

为了获得高的特异性和分辨率,智能响应的化学反应物质被应用于标记亚细胞隔室中的蛋白质或其他生物大分子。反应基团的可控活化形成高反应中间体,这些中间体一般为自由基、激发单重态或高亲电片段,通过短的扩散半径和快速反应动力学,在很大程度上减少了假阳性,并且提高了时间分辨率。一对光响应探针(如光激活和光催化脱笼)和环境响应探针(如局域金属离子、H2O2和蛋白质聚合)被成功用于亚细胞蛋白质组分析。最近报道的基于生物正交和光催化脱笼邻近标记线粒体蛋白质组学策略(CAT-Prox)被用于线粒体蛋白质组分析,通过光敏的铱催化剂提高时空精确度,表明了光响应探针在亚细胞结构蛋白质组研究中的潜在优势。尤其是可见光催化剂(包括光敏蛋白miniSOG,过渡金属铱或钌光催化剂和有机光催化剂)可以产生活性物质用于捕获邻近蛋白质,由于其低生物干扰和高时空保真度,故能够在其原环境中动态分析蛋白质。因此,光催化策略有望用于探索线粒体蛋白质组的时空动态。

本文,作者提出了一种光氧化驱动的邻近标记策略,利用具有光依赖性的线粒体靶向探针在无扰动状态下以高时空分辨率分析线粒体蛋白质组。在可见光的照射下,光控探针可以在活细胞的线粒体中自发积累并局部产生单线态氧。炔丙基胺(亲核)和被丰富的单线态氧氧化的氨基酸残基(亲电活性中间体)之间发生空间限制的反应,通过炔基柄在原位进行蛋白质共价标记,可以通过含有可裂解接头(偶氮)的生物素缀合物进行下游修饰,以通过铜(I)催化的叠氮炔环加成反应(CuAAC)富集和鉴定线粒体蛋白。此外,将一种轻型可控标记探针与基于准等重二甲基化标记的定量蛋白质组学相结合,可以很容易地破译线粒体蛋白质组,从而更好地理解线粒体功能及其在各种生理过程中的作用,阐明疾病的分子机制。该方法能够对不同细胞的线粒体蛋白进行标记和识别,并对脂多糖诱导的耐药和神经炎症过程中的线粒体进行蛋白质组动力学的研究。

结果与讨论

二溴荧光素(DBF)是一种线粒体靶向光激活探针,被选择作为光敏部分,在绿光照射下通过德克斯特能量转移可以产生充足的单线态氧(ФΔ=0.42)。以三苯基膦阳离子(TPP)为定位基团,作者设计并合成了线粒体靶向光活化探针TPP-AcDBF(Scheme 1)。

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Scheme 1 Schematic illustration of a photo-oxidation driven proximity labeling strategy and workflow for mitochondrial proteome profiling.

在本实验中,DBF被乙酰化用来提高细胞渗透性,TPP-DBF在活细胞中被胞内酯酶水解产生活性。通过测量TPP-DBF的光谱特性进行表征,最大吸收波长513nm。单线态氧(1O2)是线粒体蛋白激活和后续标记的先决条件。用单重态氧检测的线粒体可定位荧光探针Si-DMA评估TPP-DBF产生的1O2的含量,在氧化状态下,660 nm处的荧光强度大幅增加。正如预期的那样,在TPP-DBF存在下,Si-DMA的荧光强度随着自制绿光照射装置照射时间的增加而增加(Fig.1A),其波长峰值约为510nm。此外,作者在活的HeLa细胞中发现了类似的现象,在绿光照射10分钟后,Si-DMA的荧光强度更强(Fig.1B),这表明1O2的产生不受复杂细胞内基质的干扰。综上所述,证实了TPP-DBF在体外和生理条件下产生单线态氧的能力。

当这些蛋白被激活后,下一步就是对这些高活性蛋白进行标记。为了捕获氧化的氨基酸残基,通过在绿光照射下用DBF产生1O2,修饰含有潜在活性氨基酸残基(HMWY)的肽,将一组具有高亲核反应性基团(胺)和不同富集基团(炔基、生物素)的标记试剂用于蛋白质的标记和捕获。优化的标记试剂是提高线粒体蛋白标记效率的关键因素之一。根据MALDI-TOF/TOF-MS判断,炔丙胺(PA)显示出最高的效率,以组氨酸残基修饰的肽为最普遍的修饰位点,而含有其他氨基酸残基的肽(MWY)几乎没有显示修饰峰。在蛋白质水平,作者用LC-MS/MS在光氧化条件下分别检测4种试剂(PA、EA、BA、FcA)对牛血清白蛋白(BSA)的标记能力。除氧化修饰外,组氨酸残基中的PA修饰占10.4%,远高于其他标记试剂。脂肪族胺的较高亲核性和炔基较低的空间位阻使PA能够有效地标记、氧化组氨酸残基。通过对标记位点的详细分析,发现BSA中17个组氨酸残基中的13个以及5个蛋氨酸残基的1个被标记(Fig. 1C)。

将标记蛋白与叠氮生物素进行点击反应后,进行免疫印迹分析,探讨其标记机制和效果。如图1D所示,作者发现BSA的标记是在光激活探针TPP-DBF、PA和辐照都存在的前提下进行的,且标记强度随辐照时间和TPP-DBF浓度的增加而增强,提示了线粒体蛋白标记的可行性。此外,在没有TPP-DBF和绿光的情况下,BSA可以直接用1O2进行标记,这表明标记反应是通过1O2进行的,从而实现了对蛋白质标记的时空控制。

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Fig. 1 Characterization and evaluation of the photoactivatable probe and labeling reagent PA. (A) Quantification of singlet oxygen production of TPP-DBF by Si-DMA in PBS/MeOH (1:1) at 660 nm. (B) Confocal microscopy images of HeLa cells incubated with TPP-AcDBF and Si-DMA with or without irradiation of green light. Scale bar: 10 mm. (C) Labeled amino acid residues on BSA by TPP-DBF and PA. (D) Immunoblotting analysis of photo-oxidation driven labeled BSA by TPP-DBF and PA under different conditions.

随后,通过光活化探针TPP-AcDBF的亚细胞分布和PA修饰来确定标记反应的选择性。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测光激活探针TPP-AcDBF的细胞通透性和亚细胞定位。TPP-AcDBF的荧光与线粒体深红色荧光探针(Mito Tracker Deep Red)融合良好,Pearson的相关系数高达0.88(Fig.2A),表明其对自发靶向线粒体具有良好的特异性。鉴于TPP-AcDBF选择性地定位于线粒体,作者接下来以一种与罗丹明叠氮化物光激活的方式可视化PA标记,证实PA添加到蛋白质中的过程也发生在线粒体中。结果显示,在绿光照射下,细胞线粒体显示出强烈的绿色荧光,而在没有照射的情况下,罗丹明的荧光可忽略不计(Fig. 2B)。显然,这种PA加成反应是光依赖性的,具有高效的线粒体特异性。在与共轭生物素的点击反应后,通过免疫印迹分析对标记蛋白进行了相对定量,结果表明,与无绿光照射的对照组相比,在绿光照射的情况下,标记蛋白的强度明显增加,标记蛋白的富集明显增强。进一步证明了在活细胞中线粒体蛋白特异性地标记和捕获是可行的。

接着,作者测定了TPP-AcDBF在裂解细胞内的最终浓度,发现它随着孵育时间和初始浓度的增加而增加。考虑到最终浓度和线粒体特异性,最佳孵育条件是用10 μM TPP-AcDBF孵育10 min, 此时HeLa细胞内浓度为177 μM(Fig. 2C)。它比TPP-AcDBF的初始浓度高18倍,因为亲脂性阳离子的自发聚集是由线粒体膜电位驱动的,因此在线粒体中浓度会更高。此外,在所有鉴定的蛋白质中,线粒体定位蛋白的比率为78%(Fig. 2D),这是在与生物素叠氮化物偶联物发生点击反应并在该培养条件下用链霉亲和素琼脂糖珠富集后,通过无标记MS定量分析评估的最高比率。这表明了光氧化驱动邻近标记策略用于分析亚细胞蛋白质的潜力。

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Fig. 2 Mitochondria-targeting and protein labeling in vivo. (A) Confocal microscopy images of HeLa cells incubated with TPP-AcDBF (10 μM) and Mito Tracker Deep Red (100 nM). Scale bar: 10 μm. (B) Confocal microscopy images of fixed HeLa cells visualized by clicking with Azide-fluor 488 (10 μM) after incubating with TPP-AcDBF (10 μM) and PA (5 mM) in the presence or absence of green light. Scale bar: 10 μm. (C) Intracellular concentration of TPP-DBF in HeLa cells under various conditions, cells incubated with 5 or 10 μM TPP-AcDBF for different times ranging from 10 min to 1 h. (D) Ratio of mitochondrial proteins among all proteins identified by label-free MS quantification in photo-oxidation driven labeled HeLa cells under various incubation conditions.

为了评估光氧化驱动标记对活细胞的干扰,在优化条件下通过无标记定量进行全蛋白质组分析。有无探针及光照的两组实验的Pearson相关系数均大于0.98,说明标记试剂和绿光的存在影响很小。实验组与空白组差异2倍(1.5倍)的蛋白仅占全部定量蛋白的0.56%(3.08%),说明该标记策略几乎不会对细胞蛋白质组造成干扰,生物相容性良好。

随后作者利用光氧化驱动的邻近标记策略,用高分辨率MS分析HeLa细胞的线粒体蛋白质组。PA标记的蛋白通过点击反应生物素化,用链霉亲和素琼脂糖珠富集,并用LC-MS/MS进行分析。通过还原洗脱去除蛋白质中的生物素来减少干扰,促进MS鉴定。最终,鉴定了488个标记蛋白,其中310个蛋白明确定位于线粒体,其中1个定位未指定蛋白,对线粒体的特异性达到了64%(Fig. 3A)。质谱数据重现性好。亚线粒体分布表明,大部分鉴定的线粒体蛋白定位于基质和内膜(Fig. 3B),符合亲脂性阳离子的基质靶向偏好,这可能为亚线粒体定位未知蛋白提供一些思路。

在随后对已鉴定蛋白质进行的基因GO富集分析发现这些蛋白质高度参与了许多与线粒体密切相关的生物过程,如翻译和能量代谢(Fig.3C)。通过研究,作者在标记蛋白组中发现了核糖体、呼吸链复合体和内膜导入复合体的许多蛋白质亚基,它们在线粒体生物学中发挥着重要作用(Fig. 3D)。然而,标记的线粒体蛋白质组中仍有30-40%的非线粒体蛋白,这可能是光激活探针的随机扩散、生物素标记蛋白的反应效率相对较低以及样品内内源性生物素化蛋白干扰的结果。

与APEX10或TurboID相比,作者的策略在线粒体蛋白的覆盖和特异性方面表现略差,这可能是由于非生物催化过程的反应动力学低于工程酶。另一方面,与MRMs和CAT-Prox这两种具有代表性的无基因操作的线粒体化学蛋白质组学方法相比,该策略以相似的特异性绘制了最全面的线粒体蛋白质组。由于复杂的细胞环境,不同的靶向分子会聚集在线粒体内不同的微区域中,从而产生不同类型的蛋白质标记。因此,有相当一部分不同的线粒体蛋白质仅通过光氧化驱动的邻近标记策略识别,这与其他方法在一定程度上是互补的(Fig. 3E)。此外,由于TPP-AcDBF能够高效地产生1O2且PA的位阻小,所以具有高反应性和良好的空间可及性,可以识别线粒体中丰度较低的蛋白(Fig. 3F)。

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Fig. 3 Identification of the mitochondrial proteome in living HeLa cells. (A) Mitochondrial specificity of proteome profiling by integrating the photo-oxidation driven proximity labeling strategy and quantitative mass spectrometry in HeLa cells with three independent biological replicates. (B) Submitochondrial localization of identified mitochondrial proteins in HeLa cells based on the MitoCarta 3.0 database and GO cell component terms. (C) Biological processes in GO enrichment analysis for identified proteins in HeLa cells. (D) Protein complexes enriched in the mitochondrial proteome and protein–protein interactions (gray lines) which were annotated by the STRING database. (E) Overlap of identified mitochondrial proteins from HeLa cells by our method, ORMs (organelle-localizable reactive molecules) and CAT-Prox (biorthogonal and photocatalytic decaging-enabled proximity labeling strategy). (F) Abundance of mitochondrial proteins identified by our method or the other two methods. The abundance data were referenced to a previous dataset.

为了进一步验证该方法定量分析的可行性,作者通过标记索拉非尼耐药和敏感的Huh7细胞中的蛋白质,确定了索拉非尼耐药肝细胞癌的线粒体定量图谱。与线粒体功能密切相关的多种机制均可能导致索拉非尼耐药,其中包括凋亡/细胞周期失调、上皮-间质转变和缺氧环境。在索拉非尼耐药的Huh7细胞中,141个确定的蛋白中定量检测出了89个线粒体定位蛋白,这表明光氧化驱动的邻近标记具有良好的重现性和选择性。对已鉴定蛋白的GO富集分析表明,生物大分子的合成和降解、线粒体RNA调控可能对索拉非尼耐药有潜在影响。值得注意的是,与敏感的Huh7细胞相比,定量蛋白中存在许多差异蛋白,其中一些蛋白具有重要意义,例如GSTK1、CPS1、MGST3和HK2。这些与细胞代谢、耐药调节、抗氧化应激的保护以及与缺氧微环境形成相关的HIF-1信号通路密切相关,最终导致肝细胞癌中索拉非尼耐药。

HeLa和耐药Huh7细胞的鉴定结果证实了该策略的通用性和可靠性,作者推测它可能在基因上难以转染的细胞系中具有独特的优势。小胶质细胞作为中枢神经系统(CNS)的巨噬细胞,在先天免疫应答中起着重要的神经保护作用,并监测着中枢神经系统的微环境和维持其稳态。普遍认为,几乎所有神经系统疾病的进展都与小胶质细胞持续活化引起的神经炎症有关,其中线粒体起着积极作用。为了从线粒体的角度理解神经炎症,以正常HMC3细胞作为对照组,作者利用难以进行遗传操作的人类小胶质细胞系HMC3,在脂多糖(LPS)刺激的不同阶段进行光氧化驱动的邻近标记(Fig. 4A)。

从细胞毒性试验推断,当HMC3细胞与1μg mL1 LPS孵育24 h和48 h时,对细胞活力的影响可以忽略不计。在LPS刺激下,HMC3中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)的表达增加(Fig. 4B)。通过质谱定量分析,共鉴定了744个蛋白,定量分析了383个线粒体蛋白。这些蛋白质在与细胞代谢和物质运输相关的生物过程中高度富集,以满足炎症发展中的高能量和物质需求。作者注意到,用LPS刺激后,大多数确定的线粒体蛋白被下调,而在较长时间的刺激下又恢复(Fig. 4C)。推测这可能是由氧化磷酸化的减少和炎症前期糖酵解显著增加引起的。随着刺激时间的延长,促炎小胶质细胞可能会转化为抗炎表型,从而实现细胞代谢重新编码,免疫印迹分析也表明,NLRP3的表达水平最初增加,而在下一刺激阶段降低。聚焦于与刺激时间相反趋势表达的线粒体蛋白(Fig.4D),它们与促进转化出现的能量代谢和应激反应相关过程密切相关。尤其是一些与自噬/线粒体自噬相关的差异蛋白(如SNAP29, MTOR and LONP1)与神经炎症的调节密切相关(Fig. 4E)。在长时间的刺激中,PCK2、CHCHD2(重命名为MNRR1)和GPT2上调,通过谷氨酰胺代谢影响能量代谢、巨噬细胞和三羧酸循环的激活,从而影响炎性微环境的形成。显示抗炎作用的内酯酶PON2被下调,这表明长时间刺激后小胶质细胞中的氧化应激下降,进一步支持抗炎转化。研究表明,神经素炎症与自噬、线粒体能量代谢以及物质平衡的异常密切相关,并有助于神经退行性疾病的发展。此外,与叶酸和一碳代谢和转录相关的几个蛋白(FPGS、ACSF2、ACOT9、PRORP、LRPPRC和MTHFD2)的表达发生了显著的变化,但对它们在炎症和免疫应答中的功能的研究仍不完整。关注这些具有代表性的蛋白及其在炎症中所起的不明确作用,有利于神经退行性疾病的机制研究,并可能提供一些以前被忽视的信息。总之,在神经炎症的背景下分析线粒体蛋白质组动力学为线粒体介导的免疫反应和神经疾病之间的联系提供了一些有意义的观点。

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Fig. 4 Revealing mitochondrial proteome dynamics in LPS-stimulated microglia cells. (A) Workflow of dynamic mitochondrial proteome profiling in HMC3 cells stimulated by LPS. (B) Immunoblotting analysis of NLRP3 in HMC3 cells under stimulation of LPS (1 mg mL1). (C) Ratio distribution of identified proteins by comparing stimulation groups (stimulated by LPS for 24 h and 48 h) with the control group (stimlated by LPS for 0 h). (D) Heat map of identified mitochondrial proteins expressed using converse trends in the first and next 24 h. (E) Volcano plot of quantified proteins in the group stimulated for 48 h compared with those in the group stimulated for 24 h.

总结

作者开发了一种光氧化驱动的邻近标记策略,以高时空分辨率通过活细胞中的光依赖性来分析线粒体蛋白质组。光活化探针显示出优异的线粒体特异性和原位产生单线态氧的能力,有利于线粒体内的氧化残基被亲核底物共价标记。这一基于MS的策略成功地应用于揭示不同细胞(包括难以转染的小胶质细胞)中的线粒体蛋白质组动力学,并为一些与耐药性和神经炎症相关的生物学过程的研究提供了一些思路。此外,线粒体靶向光激活探针的模块化结构使可定位部分和反应部分的改变成为可能,以实现对其他细胞器和更精细的亚细胞器的标测。该策略还有望通过与上游交联或下游富集方法相结合,促进在亚细胞水平分析蛋白质组相互作用和低丰度的翻译后修饰。


理:Zhang Yuting
原文链接https://doi.org/10.1039/D2SC04087E


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