分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Peptide Recognition Sequence Guides Catalytic Side Chain Cross-Linking of Plant Peptides by Copper-Dependent Cyclases”，通讯作者是来自美国北卡罗来纳大学的Jonathan R. Chekan助理教授和Shabnam Hematian副教授，研究方向分别为天然产物的生物合成和金属酶催化机制解析。

多肽序列上不同氨基酸的侧链交联是一种较为复杂的酶促反应，目前主要依赖于含有血红素heme和铁硫簇的酶，这种多肽的环化通常起到增加刚性和抗蛋白酶水解的特性。目前已有多种N端至C端偶联或形成异肽键等环化方式，而本篇文章中主要关注于氨基酸侧链之间的交联环化情况。与常见的脱水形成酰胺键的交联方式不同，侧链交联的机理更多涉及形成高能的自由基中间体。目前已有多种酶家族被发现能够起到催化氨基酸侧链交联的作用。例如细菌中存在的rSAM酶家族，这类酶通常结合一个或多个[4Fe-4S]簇，产生高反应性自由基；最近在真菌中发现的一类酶利用二铜作为活性位点，通过氧依赖性方式催化交联。除此之外，最近发现的一类环化酶BpCs也表明铜依赖性的酶能够产生类似的交联效果。例如阿拉伯肽素作为一种重要的环肽生物碱，被证明由ArbB2酶进行催化，导致酪氨酸和亮氨酸的侧链发生C-O键交联。近期在结构上的新见解表明存在四个共定位的保守组氨酸残基，可能用于协调催化活性中心的两个铜离子。

此前的研究中已经将较长的前体肽底物进行截断为81肽，但这种底物的复杂性仍然较高，首先作者使用AlphaFold3对这一前体肽和环化酶之间的相互作用界面进行建模，首先对ArbB2活性口袋周围的序列进行建模，在保留关键的氨基酸侧链环化结构域的前提下，修改前体肽周围序列的长度，设计出一系列ArbB2酶的肽底物序列，通过在体外条件下测试交联产率，并通过MS2碎裂证实了L和Y之间确实发生了共价交联。最终测试出ArbA258-77这一序列作为最佳的底物序列。证明了催化过程中关键的基序是底物识别序列和核心交联肽序列。

随后为了确定酶催化的铜金属依赖性和氧气依赖性，作者利用该序列进行了体外交联实验。在过量的铜离子存在条件下，以1:1的酶与底物比例进行了化学计量测定。与缺乏铜的对照组相比，添加一价铜的交联转化率显著高于添加二价铜的，由此确认了一价铜作为催化活性中心的配位金属。同时作者在分别在氧气氛围和氩气氛围下进行测试，确认了氧气确实能够作为ArbB2催化反应的末端电子受体。与此同时，作者在过量底物的体系中额外添加还原剂进行测试，发现能够提高酶的催化活性，并且其中添加GSH的转化率最高。

根据AlphaFlod3的预测模型，作者预测出His237和His249对一个铜离子进行配位，而另外一对组氨酸His277和His304负责配对另一个铜离子。通过点突变实验，证明了His277位对蛋白质正确折叠存在较强的稳定性作用，同时其他三个残基都在铜结合和催化中起到不可或缺的作用。值得注意的是，发现前体肽序列中-7位置的苯丙氨酸高度保守，在其两侧通常为带电残基，因此苯丙氨酸参与环化酶的疏水口袋相互作用对促进催化过程具有重要的意义，当进行点突变后，酶的催化活性完全丧失。

随后作者测试了ArbB2能否作用于具有相似序列的肽段上，结果表明存在保守基序时，环化酶能够耐受一定程序的序列变化，说明其可能以不同的环化效率参与多种环肽生物碱的成熟过程。对于多核前体蛋白中肽段序列的交联也成功验证，通过添加GSH能使酶的活性不断得到恢复。

总的来说，本文发现了一类新型的铜离子依赖性的多肽侧链环化酶，通过自由基机制实现多肽的氨基酸侧链较为稳定的C-O键交联，交联效率与多肽核心序列以及周围识别序列有关，该方法有望应用于不同场景的多肽侧链交联。

本文作者：SHL

责任编辑：LYC

DOI：10.1021/jacs.4c15470

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c15470