Angew. Chem. :通过共价适体进行蛋白质标记和交联

  • 138
  • A+

通过生物正交反应对蛋白质进行共价修饰对于许多生物学研究和基于蛋白质疗法的开发至关重要。生成蛋白质偶联物的常用方法包括代谢标记、基于活性的标记、目标蛋白质与酶或肽标签的融合和非天然氨基酸掺入等。生物环境中对天然蛋白质进行特定的共价修饰一直具有挑战性。小分子共价配体与非共价配体相比具有多项优势,包括能够以相似的亲和力、较低浓度的剂量以及与蛋白质相匹配的作用持续与内源性配体竞争。但是,单个核苷酸的化学修饰不太可能消除它们的结合亲和力。而小分子抑制剂通常无法适应这种变化。适体在蛋白质结合方面的广泛范围以强大的方式补充了可转移合成基序提供的功能。适体在大表面积上与其蛋白质靶标相互作用。此外,寡核苷酸是通过自动化化学合成产生的,因此很容易获得。


近期,来自匹兹堡大学化学系的Prof. Dr. Alexander Deiters课题组在《Angew. Chem. Int. Ed.》上发表了一篇题为“Protein Labeling and Crosslinking by Covalent Aptamers”的文章。文章中开发了一种使用亲电共价适体在其生物环境中选择性修饰天然蛋白质的新方法。这些适体是通过在特定核苷酸位点引入接近驱动的亲电子试剂而产生的。使用凝血酶作为概念验证,作者证明了共价适体可以选择性地转移各种功能手柄,或不可逆地交联到目标蛋白。这种方法提供了广泛的可编程性和高目标特异性。此外,它解决了适体常见的问题,例如对内源性核酸酶的不稳定性和在目标参与期间的停留时间。共价适体是实现特定蛋白质修饰和灵敏蛋白质检测的新工具。此外,它们提供延长的、抗核酸酶的酶抑制作用。

1

图1. 处理转移核酸配体的一般方案。适体将其结合的功能标记和可切割的亲电子试剂引导至目标蛋白质。亲核残基与适体结合的亲电试剂快速反应,导致手柄不可逆地转移到蛋白质上。

2

图2. 用亲电试剂 A) 1或 B)  2修饰的具有特定胸腺嘧啶的单个适体分别与凝血酶孵育 4 小时和 1 小时,并通过蛋白质印迹分析生物素化效率。T13和T3修饰的适体分别显示出最有效的标记转移到蛋白质上。

4

图3. A) 与凝血酶(粉红色)复合的TBA(蓝色)的晶体结构。放大的图像显示,基于质谱测序,T3 靠近标记的赖氨酸(绿色),远离未标记的赖氨酸(黄色)。晶体结构中缺少一种生物素化赖氨酸K149。TBA(3)- 2通过质谱测序确定,当与凝血酶一起孵育时,19种赖氨酸中仅5种被生物素化。这些赖氨酸位于适体-蛋白质结合界面,基于 TBA-凝血酶晶体结构。B) 突出显示生物素化赖氨酸(绿色)和未修饰赖氨酸(红色)的标记产量的图表。质谱未涵盖的肽以灰色显示。生物素化百分比表示在指定的 Lys 残基处生物素化的凝血酶分子的分数。定量显示K149、K109-110和K36分别被91%、74%和4% 生物素化,从而证明了手柄转移适体的位点选择性。

5

图4. A) 在过量BSA (1.5 μM) 存在下的凝血酶 (300 nM) 标记选择性实验。凝血酶 (300 nM) 在过量BSA (1.5 μM) 存在的情况下被完全生物素化。B) 人血浆中的凝血酶 (300 nM) 选择性实验。使用的TBA(3)-2的浓度为0、0.06、0.12、0.25、0.5和1 μM。凝血酶和TBA(3)- 2在人血浆中孵育(≈1.5 mM 总蛋白质浓度),再次观察到高效的靶标标记,而没有其他蛋白质在高达500 nM的适体浓度下被生物素化。C) 凝血酶生物素化时程实验。凝血酶的浓度维持在300 nM。时间过程实验表明,凝血酶的共价修饰不仅具有选择性,而且速度很快,在1 μM 和0.5 μM TBA(3) -2时,t1/2分别为9.6分钟和34分钟。

6

图5. 在变性凝胶上分析荧光手柄转移。A) DEACM N-酰基磺酰胺亲电结构。B) 与使用未结合亲电试剂的非选择性标记相比,在存在过量 BSA (1.5 μM) 的情况下,使用结合物选择性处理转移到 300 nM 凝血酶。C) 选择性处理转移到人血浆中的凝血酶 (300 nM)。使用的TBA(3) -3的浓度为0.03、0.06、0.12、0.25、0.5和1 μM。

7

图6. A) 使用倒置亲电试剂进行适体-蛋白质交联。B) 浓度依赖性适体-蛋白质交联(300 nM的凝血酶)。C) 在人血浆中的选择性实验。再次显示在适配体浓度高达 500 nM(37°C 下1小时)时选择性靶向交联,与之前的结果(生物素递送适配体)相匹配。D) 时间进程生物素化实验(300 nM的凝血酶)。E) TBA-4 (1 μM) 与凝血酶 (300 nM) 的位置依赖性交联。表明交联位置依赖性与生物素化的位置依赖性相似,因此表明弹头可以很容易地从标记转移到交联互换。F) 使用500 nM 凝血酶的纤维蛋白原凝血测定。添加纤维蛋白原并在 30分钟内记录吸光度,然后外推凝血时间。与未修改的TBA相比,TBA(3)-4导致凝血时间延长2倍,表明可以通过共价交联增强适体的效力。

8

图7. A) 三种共价适体介导的凝血酶检测方法的比较,使用0.5 μM 适体进行荧光和发光检测,或使用20 nM 进行放射成像。B) 图 7 A 中数据 (0–15 nM) 的放大表示。通过蛋白质印迹法测量时的检测限为4 nM。与传统的蛋白质印迹相比,这种方法更经济,因为与抗体相反,寡核苷酸可以通过化学合成快速生成,是同质的,批次间差异很小,并且保质期长。

文章开发了一种能够快速和选择性地进行蛋白质共价标记的适体;它将生物素和荧光团等功能基序转移到缓冲液和人血浆中的天然凝血酶中。标记具有完全的蛋白质特异性和完全的赖氨酸化学选择性。交联亲电弹头的反转能够快速形成蛋白质-寡核苷酸偶联物,每个蛋白质仅结合一个适体。共价适体比其非共价对应物更有效地抑制凝血酶的酶促功能。此外,标记发生在超过内源性核酸酶降解的时间尺度上,和交联适体对核酸酶介导的降解保持免疫超过24小时。其使用非常简单的蛋白质印迹、荧光和放射照相协议,三种传递的化学基序中的每一种都实现了一种独特的蛋白质检测方法,浓度在皮至纳摩尔范围内。


作者希望这里介绍的方法广泛适用于现有和未来的适配体,并且它能够使这一类重要的基于核酸的探针在蛋白质的修饰、检测和抑制方面有新的应用。

论文信息:

Protein Labeling and Crosslinking by Covalent Aptamers

Yaniv Tivon, Gianna Falcone, Prof. Dr. Alexander Deiters


Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202101174


weinxin
我的微信
关注我了解更多内容

发表评论

目前评论: