今天分享一篇2022年发表在Chem. Sci. 上的文章，题目是“A photo-oxidation driven proximity labeling strategy enables profiling of mitochondrial proteome dynamics in living cells”。文章的通讯作者为中国科学院大连化学与物理研究所张丽华研究员。

阐明亚细胞蛋白质组的时空动态特性对于更好地理解各种生物过程是至关重要的，因为蛋白质的定位和表达水平随着环境的变化而变化，它们在生理和病理状态下的功能也随之变化。传统的线粒体蛋白质组研究策略是通过密度梯度离心法获取线粒体，这种方法耗时长，纯度低，覆盖范围小。近年来，原位蛋白质化学标记技术的出现，为实现具有高特异性和高时空分辨率的线粒体蛋白质组学分析提供了强有力的工具。基于工程酶的接近标记产生反应中间体，用于标记线粒体甚至亚线粒体蛋白质组。但这需要基因操作来构建工程酶，不适用于敏感和复杂的难以转染的组织或细胞样本。基于细胞器定位反应分子(ORM)标记特定亚细胞区室中的化学蛋白质组学技术近年来发展较快，但较低的反应速率和“常亮”类型的标记分子导致了较低的时空分辨率和额外的假阳性标记。

这篇文章，提出了一种光氧化驱动的近距离标记策略，利用具有光依赖性的线粒体靶向探针(Scheme 1)在非扰动状态下以高时空分辨率解剖线粒体蛋白质组学。光可控探针可以在可见光照射下自发聚集在活细胞的线粒体中，并在局部产生单线态氧。炔丙胺和被丰富的单线态氧氧化的氨基酸残基之间的空间限制反应允许蛋白质通过炔基柄在原位共价标记，从而通过含有可切割连接物(偶氮)的生物素偶联物完成下游修饰通过铜(I)催化的偶氮-炔环加成(CuAAC)。

线粒体靶向光激活探针，由二溴荧光素（DBF）和三苯基膦（TPP）组成。作为光敏部分，DBF在绿光照射下产生单线态氧，并通过荧光素指示探针定位。以三苯基膦阳离子为可定位部分。用Si-DMA评估TPP-DBF产生的1O2的定量，Si-DMA是一种用于单线态氧检测的线粒体定位荧光探针。在TPP-DBF存在的情况下， 510 nm绿光辐照，Si-DMA的荧光强度随着时间的增加而增加(图1A)。此外，活的HeLa细胞中绿光照射10分钟后，Si-DMA的荧光强度增加(图1B)，这表明¹O₂的产生不受复杂的细胞内基质的干扰。在光氧化条件下通过LC-MS/MS检测该策略对BSA的标记能力，发现BSA中17个组氨酸残基中有13个被炔丙胺标记，5个蛋氨酸残基中有1个被炔丙胺标记(图1C)。如图1D所示，我们发现对BSA进行标记的前提条件是光激活探针TPP-DBF、PA和辐照均存在，且标记强度随辐照时间和TPP-DBF浓度的增加而增强。

最后，在脂多糖(LPS)刺激的不同阶段实施光氧化驱动的接近标记策略。值得注意的是，大多数鉴定的线粒体蛋白在LPS刺激后下调，而当刺激时间较长时则有恢复(图4C)。作者推测这可能是由于前期促炎阶段氧化磷酸化的减少和糖酵解的显著增加。并且可能存在促炎小胶质细胞向抗炎表型的转变，随着刺激时间的延长使细胞代谢重编程。此外线粒体蛋白随刺激时间的反向趋势表达(图4D)，它们与促进转化出现的能量代谢和应激反应相关事件密切相关。并且一些差异蛋白如SNAP29、MTOR和LONP1(图4E)参与了自噬线粒体自噬过程，而自噬或线粒体密切参与神经炎症的调节。

综上所述，作者开发了一种光氧化驱动的接近标记策略来分析活细胞中的线粒体蛋白质组动态，具有高时空精度、避免遗传操作和低可见光依赖而导致的假阳性的显著优势。光激活探针显示出优异的线粒体特异性和原位生成单线态氧的能力，允许限制在线粒体中的氧化残基被亲核底物共价标记。这种基于MS的策略成功地应用于揭示不同细胞(包括难以转染的小胶质细胞)的线粒体蛋白质组动力学，并为耐药和神经炎症的生物学过程提供了一些分子见解。