对蛋白质特定位点的精准修饰是化学生物学领域的研究热点之一，尤其随着蛋白质-小分子偶联药物的不断研发，探索新的蛋白质位点特异性和化学选择性修饰方法显得尤为重要。传统的偶联方法主要集中于具有高亲核性的氨基酸，如赖氨酸和半胱氨酸，依赖于亲核性氨基酸残基和亲电性小分子之间的取代反应发生共价交联（Figure 1）。不同于赖氨酸和半胱氨酸，甲硫氨酸的疏水性和硫醚侧链的弱亲核性使其难以发生亲核取代反应。然而，甲硫氨酸易被氧化的特性使其易于通过光氧化还原催化的方法进行功能化修饰。近期，普林斯顿大学的David MacMillan教授利用天然氨基酸固有的还原电位不同，基于光氧化还原策略，发展了一种新的甲硫氨酸特异性修饰方法。在该方法中，甲硫氨酸与激活的光催化剂发生单电子转移（SET）生成α-硫代自由基，随后与烷基化试剂加成得到偶联产物。与其他发生在硫原子上的甲硫氨酸修饰方法不同的是，该方法的甲硫氨酸修饰发生在硫原子邻近的碳原子上，可生成稳定的偶联产物（Figure 1）。
首先，作者以四肽VMFP(1)为模型蛋白，亚乙基丙二酸二乙酯(2)为Michael受体探索反应条件。在筛选过多种催化剂后，作者发现lumiflavin(3)在蓝光（440nm）照射下能够有效催化该反应发生，以79%的收率得到目标产物4（Figure 2a）。作者推测反应机理如Figure 2b所示：光激活lumiflavin由基态变为激发态，继而与甲硫氨酸硫醚发生单电子转移，lumiflavin自由基阴离子(LF-, 8)使甲硫氨酸自由基阳离子7去质子化生成α-硫代自由基9和稳定的lumiflavin还原形式10。9接着与Michael受体2发生加成反应生成α-酰基自由基11。11和氢原子供体10之间发生氢原子转移，重新生成基态的lumiflavin 3和偶联产物12。值得注意的是，酪氨酸、色氨酸和组氨酸残基也可以与激活的lumiflavin发生电子转移-质子转移（ET-PT），但是相应产生的自由基中间体是亲电性的，更倾向于与10发生氢原子转移后转变为原本的氨基酸残基。因此，这种方法可以实现对甲硫氨酸的选择性修饰。此外，半胱氨酸可以与Michael受体反应，但若形成二硫键，则不会干扰对甲硫氨酸的选择性修饰。
接下来，作者以丝氨酸蛋白酶抑制剂Aprotinin为模型蛋白探索了Michael受体的底物范围（Table 1）。在最优的反应条件下，各种Michael受体均可以以较高收率完成转化。其中，13和14有多烷基化修饰的产物生成。通过该方法，生物素标签以及羧酸、伯氨和具有生物正交活性的叠氮和炔基都可以被特异性地修饰到甲硫氨酸上，体现了该方法的兼容性。
随后，作者通过一系列不同分子量的蛋白质底物来检测该方法的通用性和位点选择性。如Figure 3所示，结构中只含有一个甲硫氨酸的ubiquitin(20)和α-lactalbumin(21)分别以100%和83%的转化率得到目标产物。其中，ubiquitin(20)的反应时间延长为90min，作者推测可能是由于甲硫氨酸不在蛋白质表面的缘故。Myoglobin(22)结构中含有两个甲硫氨酸，分为位于结构表面（M55）和内部（M131）。在标准的偶联反应条件下， M55和M131的烷基化修饰比例为5:2，从而证明偶联反应速率由甲硫氨酸与蛋白质表面的距离介导。同样的情况在ecombinant human growth hormone(23)中也可以观测到。同时，作者对carbonic anhydrase(24)和ribonuclease A(25)也实现了烷基化修饰。
最后，作者评估了该方法在生物体系中的应用。如Figure 4所示，含有炔基的Michael受体17与EGFP以45%的收率得到了偶联产物26。由于EGFP在变性条件下会失去活性，因此，产物的荧光水平可用于监测蛋白质功能的完整性。对偶联产物26进行荧光检测发现，相比于野生型EGFP，26的荧光强度有95%的保留（Figure 4c），表明修饰后不影响其三级结构。利用炔基与叠氮的CuAAC反应，将26分别与含有生物素（27）和(Arg)9（28）的小分子反应可得到加成产物EGFP-biotin和EGFP-(Arg)9（Figure 4b）。EGFP-biotin可以与链霉亲和素发生特异性反应（Figure 4d, lane 3），EGFP-(Arg)9则实现了蛋白质在细胞的递送（Figure 4e）。
本篇文章中，作者报道了利用光催化剂lumiflavin实现甲硫氨酸位点选择性生物偶联的新型修饰方法。该方法反应条件温和，特异性高，且与生物体系兼容，拓展了生物大分子的修饰范围，使生物偶联不再局限于传统的亲核性氨基酸，为蛋白质药物的发展等提供了新的技术手段。
https://dx.doi.org/10.1021/jacs.0c09926https://macmillan.princeton.edu/
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