分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，文章的题目为“Detection of Protein Polysulfidation Using a β‑(4-Hydroxyphenyl)ethyl Iodoacetamide-Derived Biotin Tag HPB”，通讯作者为来自山东大学的刘怀伟教授，其团队研究方向为微生物硫代谢，合成生物学和难降解污染物的生物降解。

蛋白质多硫化修饰（Protein Polysulfidation) 作为一种新兴的翻译后修饰，近年来成为生命科学领域的研究热点。这类修饰通过在蛋白质上引入含多个硫原子的链状结构，广泛参与细胞抗氧化、信号传导、代谢调控等关键生理过程，甚至在癌症、神经退行性疾病等病理状态中扮演重要角色。然而，由于多硫基团具有高度反应性和不稳定性，且与巯基、亚磺酸等其他硫修饰化学性质相似，开发精准检测的工具一直是领域内的重大挑战。

为解决传统检测方法的局限性，此研究团队基于β-(4 -羟苯基)乙基碘乙酰胺（HPE-IAM）设计了一种新型生物素标记试剂 ——HPB（HPE-IAM 衍生生物素标签）。HPB的合成通过四步化学反应实现：首先将生物素与BOC-L-酪氨酸通过缩合反应连接，经脱保护、氯乙酰化和碘化反应后，最终形成含碘乙酰胺基团和生物素的双功能分子。相较于传统试剂IAB，HPB的关键改进在于引入羟苯基结构，该基团通过空间位阻和电子效应抑制多硫链在碱性条件下的水解，同时减少试剂自身被多硫化物还原的可能性，从而显著提升标记的稳定性和特异性。

首先在小分子模型中，HPB与谷胱甘肽多硫化物（GSSH）的反应表现出高效的烷基化能力，主要生成目标产物GSS-PB，且未检测到HPB被还原的副产物。相比之下，IAB与GSSH反应时会产生大量还原型IAB和氧化型谷胱甘肽多硫化物，表明IAB的氧化还原副反应会显著降低检测效率。在肽段和蛋白质水平的实验中，HPB的特异性优势更为突出。含单一半胱氨酸残基的肽段P1与 HPB反应后，质谱显示仅半胱氨酸位点发生单标记，非特异性双标记产物极少；而IAB处理后则出现双、三、四标记等多种副产物。在硫氧还蛋白Trx1检测中，HPB能保留66%的多硫化形式，而IAB仅能保留20%，进一步证明HPB在稳定多硫链结构上的显著优势。

为将HPB应用于复杂生物样本，研究团队优化了检测流程：在细胞裂解后引入丙酮沉淀-尿素重溶步骤，以去除细胞内高浓度的谷胱甘肽（GSH）和小分子多硫化物，避免其消耗标记试剂或引发副反应。通过该流程，HPB在结肠癌细胞 HT29的蛋白质组分析中实现了73.3%的检测准确率，显著高于IAB的67.4%。这一结果表明，HPB结合流程优化可有效降低脱靶效应，提升组学水平检测的可靠性。

值得注意的是，研究首次揭示多硫化修饰并非半胱氨酸专属，组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等含杂环或苯环的氨基酸，可通过多硫化反应在环结构上引入-SH或-SSH基团。这些非半胱氨酸修饰导致传统方法的假阳性结果，解释了为什么现有方法的准确率难以达到100%。

总之，本研究开发了一种更高效、更特异的蛋白质多硫化修饰检测工具HPB，解决了传统方法的部分缺陷，并揭示了非半胱氨酸氨基酸的多硫化修饰现象。这不仅提升了检测准确性，也加深了我们对蛋白质修饰复杂性的理解，为相关疾病机制和药物研发提供了新视角。

本文作者：LJF

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/acs.analchem.5c00712

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c00712