分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Precise de novo Design Principle of Antifreeze Peptides”，通讯作者为天津大学张雷教授，其研究方向为功能生物材料。

防冻蛋白（AFPs）最早在极地地区的嗜冷菌中被发现，它们是目前已知的最有效的冰生长抑制剂，有望应用于医疗、食品等诸多领域。目前认为AFP表面的特定氨基酸残基（称为冰结合位点，IBS）可通过合适的排列模式结合冰晶格，从而抑制后者的生长，但对于其中构-效关系仍知之甚少，AFPs的从头设计仍是充满挑战的。另一方面，防冻肽（AFPTs）被认为是AFPs有力的替代，它们在保留了冰晶格结合能力的同时具有更低的免疫原性。目前获得AFPTs的方法主要有从天然蛋白中截断改造和噬菌体展示筛选，尚未有指导AFPTs从头设计的原则。

本文中，作者首先探究了AFPTs IBS的残基偏好性。在天然AFPs中，最常见的冰结合氨基酸残基是T，其次为N、S。作者猜想T可能不是具有最强冰晶格结合能力的残基，于是他们通过MD模拟评估了20种天然氨基酸残基与冰晶格的结合能，结果显示，带有羧基的E和D具有远高于其他残基的冰晶结合能（其中E的结合能是T的4倍）。为了验证这一模拟结果，作者选取了两条来自天然防冻蛋白截短肽，并用E替代它们IBS基序（TXT）中的一个或两个T。结果显示，在两种AFPTs上将TXT替换为EXE均显著地提升了它们在溶液（0.25 wt%）中的冰晶生长抑制能力，证实了E是一种具有更强冰结合能力的残基。

如前所述，影响AFPs/AFPTs活性的结构因素不仅有IBS的残基种类，还有它们的排列模式。具体而言，IBS位点之间的距离应与冰晶格中O原子之间的距离匹配。作者选择了冰晶体的棱柱平面中两个O原子可能的几种距离：1、1.5、2或3个冰晶格，并以此作为肽设计中两个IBS残基之间距离的约束。作者从E取代的TmAFP截断肽起始，通过微调折叠中的非功能氨基酸来使IBS之间的距离与上述距离相匹配，得到了设计的化合物E1~E5。值得一提的是，为了预测这些肽在低温下的构象，作者开发了一种优化的结构预测平台来适应生物体液凝固点附近过冷的温度（可低至-13°C）。在这一平台下，作者预测了E1~E5在260 K下的构象，并成功实现了距离匹配。

随后，作者验证了E1~E5在0.25 wt%溶液中抑制冰晶生长的能力，其中IBS距离为6.4 Å（1，5个晶格）的E2显示出了最强的抑制能力，可将冰生长速率降低10倍以上。进一步地，作者挑战了不依赖天然模板，完全从头设计AFPTs。作者向一段含A、G、P和S的随机序列中插入两个E作为IBS，随后通过微调序列使得IBS之间的距离匹配至8.6 Å，分别得到化合物E6~E7。实验表明这两种化合物也具有冰生长抑制能力，且随着距离的优化而增强。

最后，作者通过相似的原则引入了3个E残基来匹配平面上的3个O原子，并将得到的化合物应用于细胞冻存。结果显示该肽很好地保护了冻存细胞的活力，优于通用的冻存液。总结而言，作者提出了一种用于共价肽设计的指导性方法，将其称为“Site to Distance”原理，即首先优化IBS位点处残基的种类，随后匹配IBS之间的距离。

本文作者：TYC

责任编辑：MB

DOI：10.1021/jacs.4c18537

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c18537