分享一篇发表在Nature Methods上的文章，题目为“Mild and ultrafast GLORI enables absolute quantification of m6A methylome from low-input samples”，通讯作者是来自北京大学的伊成器教授和来自中科院遗传与发育生物学研究所的王秀杰教授，研究方向为DNA和RNA上的表观遗传学。

m6A修饰是RNA上十分重要的一种表观遗传修饰，会对RNA的稳定性和翻译效率造成影响，并影响部分的生理和病理过程。为了实现对m6A的绝对定量和精确定位，研究人员此前已经开发出一种基于测序的单碱基分辨率的方法GLORI 1.0，即利用乙二醛和亚硝酸盐，对未甲基化的腺苷进行脱氨变为肌苷，在逆转录过程中被读取为G，而m6A被读取为A，从而使其在测序过程中得以分辨开来。但GLORI 1.0方法存在反应时间长、RNA降解、需要细胞量大等缺点，本文在其基础上进一步优化，使得能够对比以往所用RNA材料起始量低一至两个数量级的样本的高效灵敏定量。

首先确定了GLORI方法中使用乙二醛对鸟苷进行保护的步骤是导致RNA降解的主要原因，对整个实验流程进行总结，发现当乙二醛对腺苷反应后生成强的亲核试剂后，增加对亚硝酸盐的反应活性，从而使得对鸟苷保护的步骤不是必要的。最终优化出一锅法的反应策略GLORI 2.0，反应条件为50 °C反应10 min，实现短时间内腺苷的高效脱氨并保证RNA几乎不被降解。

GLORI 2.0方法能够实现对起始10000个细胞量的全转录组m6A定量。随后证明了2.0版本比1.0版本相比，需要更少的起始样本量就可以达到相近的检测效果。在相同的测序深度内，2.0版本能够鉴定到更多的修饰位点。与其他方法相比，GLORI 2.0能够对转录本上的腺苷进行完全脱氨化，并且在基于靶向扩增方法的位点特异性的m6A定量中表现出优势。

进一步对于更加稀缺的生物样本，开发出GLORI 3.0方法。其掺入了带有氰乙基化修饰的、无法逆转录的carrier RNA，最大限度减少样本中的RNA丢失及降解，同时不会影响cDNA文库的生成，实现低至1000细胞左右中的修饰RNA的定量。

随后，作者发现该方法在应用于500个细胞的体量中（约10 ng总RNA）时也能够获得合格的测序文库，检测到可信的m6A甲基化组。最后，作者将这种方法应用于对单个小鼠背侧海马体的突触和细胞质部分的 m6A 甲基化组的检测和定量。检测出突触相关基因的高甲基化状态，支持m6A在调节对外部刺激响应过程中的重要作用。

总的来说，本文优化了该团队之前所开发的GLORI测序以定量RNA上m6A修饰的技术，使其能够温和且快速地实现1000-10000数目的起始细胞量中的全转录组RNA的m6A修饰的定量。

本文作者：SHL

责任编辑：WYQ

DOI：10.1038/s41592-025-02680-9

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-025-02680-9