推荐一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的论文，通讯作者是来自芝加哥大学的何川教授，他的研究方向主要涉及化学生物学、核酸化学和生物学、表观遗传学等方面的研究。
RNA动态可逆的化学修饰（如m6A）可以调控许多生物学过程的相关功能，高通量检测m6A位点的方法有MERIP-seq，该方法使用m6A特异性抗体富集含有m6A修饰的RNA片段后进行高通量测序，从而来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域。该方法不仅需要的样本量较大、分辨率较低，而且对甲基化的比例也无法进行定量。
在SELECT方法中，Up探针和Down探针的DNA寡核苷酸分别与假定的m6A位点的上游和下游的RNA模板结合，从而在修饰位点的位置上留下1-nt的间隙，m6A的修饰会阻碍Bst DNA聚合酶介导的cDNA延伸和SplintR连接酶介导的连接，进而对FTO-(未去甲基化)和FTO+(去甲基化)RNA样品形成不同量的产物通过qPCR进行定量检测，用于在选定的m6A修饰位点的验证、检测和定量。基于该方法，当未甲基化的RNA作为模板时，只观察到仅约11%Up、Down探针的连接，亟待于优化。（图1）
本研究发现，在45°C下进行延伸，在连接步骤中添加PEG8000有助于提高连接效率；此外为了获得高选择性，筛选了用于延伸和连接反应的时间组合。理论上，不能延长、连接的Up探针不仅包括受到m6A修饰阻碍的群体，也包括结合到RNA模板的靶外位置或者没有被Bst DNA聚合酶催化结合的群体，后两种情况如果错误地算作m6A修饰将严重扭曲结果。因此，作者设计了远离目标修饰位置3-nt的Up探针，3-nt间隙使Up探针在到达m6A位点之前延长两个核苷酸，而结合到靶外位置或未被Bst聚合酶催化的Up探针要么根本不伸长，要么以不正确的序列伸长，大大提高了检测的准确度。
在优化实验方案后，作者将升级的SELECT方法与二代测序相结合，以开发Lead-m6A-seq方法。首先将DNA探针与RNA模板反应的RNA/DNA杂交物采用oligo(dT)磁珠纯化，随后RNA模板被消化，并将cDNA 3’端与15-nt UMI标签开始的adapter进行连接，通过PCR扩增cDNA，并进行相应测序，由于在5‘末端缺乏启动序列，没有连接在一起的Up、Down探针不会被扩增，因此也不能通过测序检测到它们。作者还对方法进行了验证，将目标位置含有不同比例的m6A RNA作为校准模板，通过Lead-m6A-seq方法测定结果显示探针的连接分数与m6A比率呈良好的线性关系。但是，该方法对于靶向合成的RNA是有效的，但在真实生物样本中的RNA m6A位点连接效率较低。因此作者在不考虑Up、Down探针连接的情况下，发现Up探针通读率与m6A比率的线性显示更好的选择性，表明该方法的选择性主要由Bst DNA聚合酶决定，在Lead-m6A-seq方法中，不再需要SplintR连接酶连接到Down探针。(图2)
总之，本论文针对前期建立的m6A修饰位点测定的SELECT方法进行了优化，并结合二代测序的技术开发了Lead-m6A-seq，通过高通量测序，测定位点特异性DNA探针的延伸，以高通量评价选定位点的m6A修饰。
本文作者：ZJ
责任编辑：CY
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202007266
原文引用：10.1002/anie.202007266
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