分享一篇2022年发表在Analytical Chemistry上的文章,题目是“Fluorogenic and Mitochondria-Localizable Probe Enables Selective Labeling and Imaging of Nitroreductase”。文章的通讯作者为葛敬岩教授。
缺氧是一种低于正常水平和氧气供应不足的状态,这是许多实体肿瘤的常见特征,低氧可刺激基因突变,诱导多种细胞内信号通路,包括低氧诱导因子(HIF)通路,从而改变癌细胞的代谢,最终导致治疗耐药。缺氧不仅与肿瘤的进展密切相关,而且对肿瘤的预后也具有致命性。因此,高效、准确地实时检测低氧水平具有重要的临床意义。
据报道,包括硝基还原酶(NTR)的一些还原酶在缺氧的肿瘤微环境中表现出较高活性,它们的表达水平与缺氧程度密切相关。因此,NTR可能是反映细胞和生物体缺氧状态的关键生物标志物之一。NTR是NAD(P)H/FMN氧化还原酶家族的成员,催化含硝基取代的芳香族或杂环化合物进行电子重排,进一步还原为羟胺或氨基类似物。利用这种独特的催化功能,结合先进的荧光机制,包括光诱导电子转移(PET)、分子内电荷转移(ICT)等,人们已经开发出多种用于监测NTR的小分子荧光探针。然而,这些探针不可避免地会扩散到其反应部位之外,导致样品固定不当、NTR定位的准确性较低、信噪比较低。
基于上述问题,作者设计并合成了一种能够选择性反应和捕获硝基还原酶的改性染料FY(图1)。其中,选择了具有高稳定性的近红外和双光子光谱特性的半花青基荧光团作为核心分子;对硝基苄基用作NTR的识别基团和笼子,通过吸电子硝基和ICT过程来猝灭探针的荧光;芳环上的氟甲基起着离开基团的作用。此外,还利用四元含氮杂环对线粒体进行了定位。
图1 探头FY的设计和化学结构。当硝基被NTR还原时,电子重排后的探针释放出氟,并产生反应性的苯醌甲基中间体。在NTR中,荧光的激活和亲核试剂(Nu)的结合同时发生。其次,作者研究了FY的光物理性质和选择性。如图2B所示,FY在460 nm附近显示一个吸收带,荧光很低。还评估了FY对NTR的体外反应,在PBS缓冲液(pH 7.4)中,将纯化的大肠杆菌NTR(500μg/mL)加入探针(20μM)和NADH(500μM)的混合物中,在10分钟内观察到强烈的荧光增强(图2C),表明FY对NTR具有快速响应。然后,分别用不同浓度的NTR(0−500μg/mL,图2D)和探针(0−25μM,图2E)获得荧光光谱,随着NTR和探针浓度的增加,探针的荧光强度增大。为进一步测试NTR的特异性,FY与不同的生物分析物进行培养 (图2F),结果表明,FY仅在NTR和NADH条件下对其他生物相关物种具有高度选择性。这也表明NTR是一种双底物酶,需要NADH作为辅因子来提供电子,以催化硝化生成氨基。接下来,作者还对FY在酶激活后是否能够共价标记蛋白质进行了评估,如图2G所示,只有在FY、NTR和NADH存在的情况下才能清楚地观察到荧光蛋白条带,而不是只有NTR或BSA存在。实验证明FY不仅是酶敏感的,而且是一种活性依赖的标记探针。图2 (A)FY的合成路线。(B)FY(20μM)在PBS(pH 7.4)中与NADH(500μM)在37℃下培养30分钟前后的紫外可见吸收光谱和荧光光谱。(C)FY(20μM)在PBS(pH 7.4)中与NADH(500μM)存在下与NTR(500μg/mL)培养时的时程荧光强度。插图是在白光(左,Abs)下使用iBright(右,FL)拍摄的三种反应的照片。(D)FY(20μM)在NADH(500μM)存在下与NTR(0-500μg/mL)在37℃反应30分钟前后的荧光光谱。(E)在NADH(500μM)存在下,不同浓度的FY(0-25μM)与NTR(200μg/mL)在37°C作用30分钟的荧光光谱。(F)FY(20μM)对PBS中各种分析物的荧光响应。λex/λem=520/560 nm。1.游离探针;2.K2CO3 1 mM;3.NaOAc 1 mM;4.甘氨酸(Gly)1 mM;5.天冬氨酸(Asp)1 mM;6.DTT 100μM;7.GSH 100μM;8.H2O2100μM;9.NADH 500μM;10.BSA 200μg/m l;11.Trim21 200μg/m l;12.脂肪酶200μg/m l;13.NTR 500μg/m l;14.NTR500μg/mL+NADH500μM。(G)凝胶内荧光扫描和考马斯亮蓝染色体外标记探针(50μM)。在含或不含NADH(500μM)的PBS中分别加入或不加入探针,37℃培养2 h。在成功展示FY的体外NTR敏感和共价标记特性后,作者评估了它们在活细胞中的应用。将A549细胞在常氧和低氧(3%氧气)条件下培养8h,然后用FY、NY或赋形剂对照组(0.1%DMSO)染色1h,用DMEM液多次洗涤并成像。如图3A所示,FY和NY处理的细胞与DMSO处理的细胞相比显示出荧光反应,表明了探针可能对NTR具有催化敏感性。以及暴露在低氧浓度下的细胞比常氧条件下的细胞产生更强的荧光增强,表明了评估的低氧细胞的NTR活性刺激了探针的打开。此外,文章还研究了用甲醇固定后荧光信号是否能被保留。从图3B可以看出,固定后使用FY的细胞能够很好地保留荧光信号,低氧条件下的细胞产生更高的荧光信号,而NY处理的细胞几乎没有信号,表明在NTR激活后,FY能够共价固定。
图3 不同条件下A549细胞的共聚焦成像。(A)用FY/NY(20μM)在常氧和低氧(3%)条件下对活的A549细胞进行荧光成像。荧光增益设置为700。(B)A549细胞在常氧和低氧(3%)条件下经100μM、NY和FY处理8h后的荧光图像。然后,用甲醇固定细胞15min。荧光增益设置为800。将MitoTracker深红(10 NM)与细胞培养,并加入探针。比例尺=25μm。
为确认FY在其他模型中对NTR的适用性,作者先对正常细胞(HEK293T)和癌细胞(A549)进行了成像和流式细胞术检测,观察到(图4A)A549的荧光(用流式细胞仪定量5倍,图4B)比HEK293T强得多。接下来,他们对斑马鱼进行了体内成像分析,如图4C所示,用探针处理的鱼显示出可检测到的荧光。进一步说明了FY可作为体内NTR实时监测和相关机制研究的一种有前景的工具。
图4 (A)经FY(20μM)处理的A549和HEK293T细胞的共聚焦成像。Scale Bar=25μm。(B)FY(50μM)处理后对两个细胞进行流式细胞仪分析。(C)活的2日龄斑马鱼与FY/NY(20μM)在常压和低氧(3%氧气)下培养30分钟后的荧光图像。比例尺=1 mm。“合并”图像:亮场和探测通道叠加。综上所述,作者成功设计并合成了一种NTR可激活的、荧光的、线粒体可定位的、基于QM邻近的蛋白质标记探针FY。这种NTR探针不仅提供了线粒体可定位的荧光响应,而且在激活部位实现了永久保留,提高了空间分辨率和检测灵敏度。原文链接:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c00512
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