给大家分享一篇JACS上的文章，” Direct in Vitro Selection of Trans-Acting Ribozymes for Posttranscriptional, Site-Specific, and Covalent Fluorescent Labeling of RNA”，本文通讯作者来自维尔茨堡大学有机化学研究所的Claudia Höbartner教授，该课题组研究的方向为合成经过化学修饰的DNA和RNA，开发DNA催化剂，核酶和RNA适体，并探索它们在化学和生物学领域的功能和创新应用。

RNA标记和可视化是研究RNA定位，折叠和结构动力学的关键条件。尽管目前已经报道了用于对RNA位点特异性的引入目标碱基和共价标记RMA的许多化学和化学酶方法。但是目前如果需要将外源序列插入靶RNA中，可能对RNA的结构和功能产生不必要的影响。

RNA标记的另一种方法是比较经典的方式为工程化的核酶。其中，它从目标RNA进行断裂，并用标记的RNA进行替代。基于序列互补性，核酶可以用于各种靶向RNA，但是多步反应的效率有限阻碍了广泛的应用。因此，需要一种方式，实现位点特异性高效插入目标的碱基。在这项工作中，作者发展了多种通用的RNA核酶，可用于体外RNA靶的常规和高效位点特异性标记。

作者从使用N6-生物素-ATP作为小分子选择底物，从结构随机RNA库中，并在温和的反应条件下，以高产率催化标记的核苷酸在特定位置实现标记，从而体外鉴定出RNA催化剂核酶。RNA库中包含假设的底物序列和一对与底物序列互补的识别臂。作者选择未配对的腺嘌呤A作为标记反应的目标位点，如果核酶能够催化A与ATP的反应的话，由于ATP中引入的biotin，可以通过富集的方式将其富集出来。富集出来的RNA进行逆转录，并通过PCR扩增cDNA，以生成dsDNA模板。然后通过T7 RNA聚合酶转录进入下一轮选择的随机RNA库中。初步测试还表明，随机RNA库中的某些核酶能够催化反式中的生物素化反应。

接着，作者从成功克隆的23个质粒进行测序，确定了三个主要序列组，并将这些代表性序列标记为FH14，FH20和FH31。活性测定表明，所有三个核酶，都具有所需的反式活性，即修饰发生在底物序列中，而不在核酶链上。在2小时的反应时间后，标记的RNA>60%，因此FH14核酶被证明是最有效的核酶。

为了鉴定生物素化腺苷与靶RNA的连接位置，分离了RNA催化的标记反应产物，并对其进行了RNase T1探测和碱水解。以未修饰的底物序列用作参考，并显示出不受干扰的水解阶梯。相反，生物素标记产物显示了在水解模式中的缺口，即在A10处，缺少了与切割相对应的条带，并且在A10之后的切割所产生的条带移位。这些结果表明，修饰位于A10的2'-OH，其对应于结构化RNA库中的设计标记位点。

为了检查FH14和FH31核酶的小分子底物范围，作者测试了N6-ATP，该底物与生物素化的选择底物相比，缺少生物素部分和未修饰的ATP。动力学实验的结果表明，生物素不是必需的底物要求。同时，作者使用了三种不同的荧光团，包括荧光素，ATTO550和Cy3，它们通过N6-氨基己基-ATP连接，都可以实现很好地连接。

为了证明FH14在标记生物学相关RNA中的应用，作者选择了大肠杆菌5S rRNA作为丰富的细胞起源RNA。选择120 nt RNA不同序列和结构背景下的三个腺苷作为标记的候选位点。体外转录的3'-荧光素标记的5S rRNA，用于测试FH14核酶的标记潜力。孵育2小时后，ATTO550-ATP附着在所有三个选定位点。通过结合两个或三个核酶，可以实现多个生色团的插入以增强标记产物的亮度。

总之，在这项研究中报道的核酶是用于RNA的位点特异性标记的高度通用和高效的反式核酶。

本文作者：LSC

本文链接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.9b10531

DOI: 10.1021/jacs.9b10531