分享一篇发表在ACS Cent. Sci.上的文章，题目为“Diversity Scale of Library Matters: Impact of mRNA Library Diversity Scales on the Discovery of Macrocyclic Peptides Targeting a Protein by the RaPID System”，通讯作者是东京大学化学系的Hiroaki Suga，他们课题组的主要研究方向是人工核酶，遗传密码子重编程和非标准肽等。

大环肽配体因其高亲和力、特异性和调节蛋白-蛋白相互作用的能力而从传统药物模式中脱颖而出。为了发现靶蛋白的新型环肽配体，研究人员开发了多种策略，例如DNA编码的文库、噬菌体展示、酵母展示、mRNA展示等。近期，将mRNA展示与遗传密码子重编程结合建立的随机非标准肽集成发现系统（Random nonstandard Peptides Integrated Discovery，RaPID）实现了含有非天然氨基酸的大环肽的从头构建，且在RaPID系统中使用的文库大多包含1012-1014个独特的mRNA序列，文库筛选得到环肽配体通常具有nM级的解离常数（KD）。尽管大家普遍认为文库的多样性与筛选得到的环肽配体的结合性质有显著的关联，但并没有人系统性地对此进行探究，于是本文作者构建了多样性不同的mRNA展示文库，系统性地探究文库多样性对多肽配体结合性质的影响。

作者选择了他们之前研究过的肝细胞生长因子受体（MET）进行探究，构建了如图所示的环肽库。该文库通过起始的AUG编码的ClAc-LTyr和末端UGU编码的Cys来实现环化，二者之间是随机的氨基酸。为了构建不同多样性的mRNA文库，作者通过引物延伸和PCR制备了NNK15 DNA文库的一个子集，进行独立采样，分别得到初始的E14和E12库，之后对它们分别稀释得到后续多样性减少的文库。

然后作者进行了常规的筛选，对每个文库筛选出来的top6或者top7的序列重新合成出来，测定其动力学常数（ka和kd）和解离常数（KD）。

通过分析不同文库筛选出来的肽性质，作者发现在低多样性的文库（E6或E8）中，有效的肽结合剂会在后面几轮筛选中出现；在中等多样性的文库（E10）中，能捕获强多肽结合剂和弱多肽结合剂，但也会错失一些有效肽；在高多样性的文库（E12或E14）中，可以捕获强多肽结合剂以及发现具有独特序列的多肽结合剂。综合他们的分析结果，作者也为如何调整合适的选择压力，从而得到想要的多肽配体提供了一些建议。

综上所述，作者系统地探讨了mRNA展示文库的多样性对多肽配体筛选的影响。

本文作者：LZ

责任编辑：MB

DOI：10.1021/acscentsci.4c01021

原文链接：https://doi.org/10.1021/acscentsci.4c01021