分享一篇2023年发表在Analytical Chemistry上的文章，题目是“Near-Infrared Ratiometric Hemicyanine-Based pH Fluorescence Probe with Bone Targetability for Monitoring Bone Resorption”。文章的通讯作者是山东大学魏福兰教授。在正畸治疗过程中，准确检测骨吸收极为重要，因为它可以为临床治疗策略提供依据。近年来，pH响应荧光探针因其灵敏度高、特异性好、原位检测能力强、实时检测能力等特点，在骨吸收监测领域受到广泛关注，但仍存在一些缺点，如使用双膦酸盐作为骨靶向部分会增加颌骨坏死的风险，以及易受干扰导致监测精度不足。pH响应荧光探针是一种小分子探针，当周围环境的pH值发生变化时，这种探针会发生超分子转化，从而激活或猝灭荧光效应，实现对pH值的检测，进而监测破骨细胞的骨吸收活性。目前，用于监测骨吸收的pH响应荧光探针主要是基于强度的类型。这类探针具有ON/OFF开关，利用探针荧光信号在暴露于H＋前后的增强或猝灭来可视化特定范围内的pH值变化。比例pH荧光探针在检测骨吸收活性方面具有更大的优势。作为一种比例pH荧光探针分子，半菁（Hcy）染料因其具有高吸收系数、高荧光量子产率、末端基团的可修饰性以及可调的激发和发射波长等优异的光学性能，引起了研究人员的极大兴趣，并被广泛用于设计监测活细胞或组织中生理活动的近红外pH荧光探针。在此，我们开发了一种近红外比率pH荧光探针Hcy-Asp6，它具有准确监测骨吸收活性和骨靶向性的能力，靶向部分几乎不会对颌骨产生潜在的不利影响，以Hcy为主要骨架，Asp6为骨靶向剂，并将两者化学连接在一起（方案1）。
方案1. HCY-ASP6骨吸收活性监测机制。
pH响应型荧光探针的光物理特性对其临床应用功能极为重要。在一系列pH缓冲溶液（pH 2.18-9.14）中检测并记录Hcy-Asp6的紫外-可见吸收和荧光光谱。如图1b所示，Hcy-Asp6在不同的pH缓冲液中显示出两个最大吸收波长：酸性溶液中的606 nm和碱性溶液中的690 nm。随着pH值从2.18增加到9.14，探针溶液的颜色明显由蓝色变为青色，同时最大吸收率明显红移（图1b）。同样，随着pH值从2.18增加到9.14，最大发射波长从678nm移至715nm（图1c）。当pH值从2.18变为9.14时，吸收和发射波长呈深致变色变化趋势，表明荧光发射强度比与pH值之间可能存在关系。显然，荧光发射强度比（I678/I715）随着pH值的增加而降低（图1d）。而且，不难发现pH值与I678/I715之间存在良好的线性关系。在5.0-6.5的pH范围内，相关系数为0.99，表明该pH范围与骨吸收时的pH范围（约4.7-6.8）基本一致，证实了该探头可用于监测骨吸收的pH值。此外，荧光团的化学稳定性对于它们在生命系统中的长期成像至关重要。图1e显示，当我们在5.40-6.50之间循环调节pH值时，Hcy-Asp6的I678/I715变化迅速，表明Hcy-Asp6对H＋具有优异的可逆响应。同时，计算得出Hcy-Asp6的pKa为5.92，与体内骨吸收的pH值相匹配，适用于监测骨吸收的pH值变化。此外，还研究了Hcy-Asp6的光稳定性和抗干扰能力。如图1f所示，在两种pH缓冲溶液（pH 2.24/6.86）中，Hcy-Asp6的发射强度比（I678/I715）在2 h的测试时间内均保持稳定，因此具有良好的光稳定性。由于激发光对荧光物质具有光漂白作用，会导致其光学性能下降，从而对荧光探针的检测产生不利影响，因此合成的荧光探针具有很强的抗光漂白性（高光稳定性）对于探针的应用非常重要。如图1f所示，该探头满足此要求。除了光稳定性外，在体内和体外复杂环境中进行精确监测还需要具有良好抗干扰能力的探针。这是因为在体内骨吸收过程中，除了H＋的变化外，Ca2+和K+等也会发生变化。正如预期的那样，在不同阳离子（Na+、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Cu2+、Al3+）存在的情况下，I678/I715并没有发生显著变化（P> 0.05），但仅针对不同的pH值（P < 0.0001，图1g），表明Hcy-Asp6对H+具有较强的选择性（抗干扰能力强）。以上综合分析表明，Hcy-Asp6具有优异的光物理能力，满足骨吸收体内pH值变化检测的要求。
图1. Hcy-Asp6光学特性的表征。（a）Hcy-Asp6的pH响应机制。（b）紫外-可见光吸收和（c）Hcy-Asp6（10 μM）在含有1% DMSO的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中对不同pH值的荧光强度光谱。（d）荧光发射强度比（I678/I715）和pH值在2.18-9.14之间。（e）Hcy-Asp6在pH值为5.40和6.50的可逆反应I678/I715。（f）Hcy-Asp6在pH 2.24和6.86下2 h内荧光强度比（I678/I715）的变化。（g）Hcy-Asp6对不同pH值缓冲液中不同电解质溶液的荧光响应（pH值为2.86/7.52）。
为了确定探针的骨结合能力，并量化荧光强度和pH值之间的关系，研究使用了骨切片（图2a）。在图2b中，所有组在各种pH环境下都表现出荧光信号，证实了探针的骨靶向能力。此外，Hcy-Asp6的荧光强度表现出pH依赖性特征，即随着pH值从4.50增加到9.14，青色通道（678 ± 15 nm）的荧光强度逐渐下降，而红色通道（715 ± 15 nm）的变化则相反。按照设计，荧光强度比（I678/I715）在5.00至6.86的pH范围内显示线性响应（图2c）。这种线性拟合结果表明，该探针可通过计算荧光强度比（I678/I715）来估计pH值。综上所述，上述结果证实了Hcy-Asp6具有优异的骨靶向能力，在pH值在5.00-6.86之间表现出pH响应特性，表明Hcy-Asp6可用于靶向递送至骨组织，监测骨吸收的pH值变化，以及骨吸收的可视化。
图2. Hcy-Asp6与不同pH值下骨切片结合的共聚焦荧光成像。（a）Hcy-Asp6与骨片结合的示意图。（b）pH 4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、6.86和9.14的代表性荧光图像。（c）荧光发射强度比（I678/I715）和骨片中的pH值。
为了证明Hcy-Asp6在体外骨吸收过程中监测pH值变化的能力，我们通过在皮质牛骨切片上培养破骨细胞来构建体外骨吸收模型。然后，对用Hcy-Asp6预孵育的骨片上培养的破骨细胞进行共聚焦荧光成像。如图3a所示，在骨切片上培养大鼠BMSCs3天后，Ob组的青色通道和红色通道中只有背景荧光信号。相反，在Oc组中捕获了多核破骨细胞外围的增强荧光信号。众所周知，破骨细胞在骨吸收过程中会形成肌动蛋白环，与骨表面产生紧密接触，从而产生一个特殊的膜区域，称为荷叶边，负责分泌质子和胶原溶解酶。这种释放的H＋可以溶解骨骼中的无机物，导致骨吸收，并响应该探针，引起探针荧光信号的变化，这与图3a的外观相符。以往的研究已经证明，破骨细胞在进行有效的骨吸收时，会在骨骼上的相应部位形成圆形的吸收坑和细长的吸收沟。通过观察三维荧光图像的横截面视图，在破骨细胞和骨片之间存在探针的荧光信号（图3b，白色箭头）。换句话说，由活性破骨细胞引起的骨吸收坑被探针选择性标记，并响应激发光显示荧光信号，表明骨吸收正在进行中。此外，为了进一步研究骨吸收过程中的pH值，计算Oc组的I678/I715为2.17±0.27（图3c）。然后，根据图2c中的pH校准曲线，计算出体外骨吸收的pH值约为5.26±0.70（图3d），与先前的研究结果一致。上述结果令人信服地证明，该探头可以监测骨吸收过程中的pH值变化，并可视化骨吸收。
图3. 体外Hcy-Asp6监测骨吸收。（a）用Hcy-Asp6在骨切片上培养的成骨细胞（Ob）和破骨细胞（Oc）的荧光成像。（b）切片骨吸收的三维荧光显微照片和横截面图;白色箭头表示Z轴上的荧光信号。（c，d）荧光强度比（I678/I715）体外骨吸收分析（c）和pH分析（d）。
在我们证明Hcy-Asp6可以在体外监测骨吸收后，我们构建了正畸牙齿运动模型，以研究Hcy-Asp6是否可以成像骨吸收并检测正畸治疗期间的pH值变化（图4a、b）。在正畸治疗过程中，由于正畸力导致受压骨组织局部缺血坏死，受压侧的牙槽骨聚集促炎细胞因子，包括组织坏死因子、白细胞介素-1、前列腺素等，迅速激活破骨细胞分泌H＋促进骨吸收。有研究表明，正畸力负荷增加了破骨细胞的数量，并在第7天显着增加。因此，将镍钛闭合螺旋弹簧固定在大鼠口腔牙齿上后，将Hcy-Asp6皮下注射到骨吸收的相应部位，然后在施加加载力的0 d和7 d用双光子激光共聚焦显微镜拍摄荧光图像。如图4c所示，肉眼观察到0 d和7 d的荧光信号，但7 d的荧光面积明显大于第0天。荧光区域的定量分析进一步表明，7 d时的荧光区域明显大于0 d时的荧光区域（P < 0.0001）（图4d），表明施加力7 d后pH值变化区域显著增加，骨吸收活性更高。这一结果与正畸骨吸收术基本一致。然后，每只大鼠随机选择三个荧光区域对I678/I715进行分析（图4e）。I678/I715在7 d时（1.69 ± 0.26）略高于0 d时（1.66 ± 0.25）；但两者之间无显著差异（P > 0.05）。同样，根据上面的pH校准曲线（图2c），0 d组和7 d组的pH值分别为6.61±0.65和6.54±0.68（图4f），也没有明显差异（P > 0.05）。因此，监测大鼠正畸骨吸收的实验结果表明，Hcy-Asp6可以通过整合荧光成像和骨吸收区域的pH值来实现正畸力应用过程中骨吸收活性的检测，从而为临床正畸治疗中的骨吸收监测提供了可行的思路。
图4. Hcy-Asp6 用于监测大鼠正畸骨吸收活性。（a）大鼠正畸骨吸收模型原理示意图。（b）大鼠牙齿移动的口内正畸力应用。（c）正畸力施加0 d和7 d时大鼠骨吸收活动的三维（3D）荧光图像的最大强度投影（MIP）重建。荧光区域分析：（d）3D荧光图像的荧光强度比分析（e）和pH分析（f）。
在这项研究中，我们通过将Asp6移植到Hcy上，成功开发了一种具有荧光成像和pH响应能力以及骨靶向性的Hcy-Asp6探针，该探针能够靶向结合骨组织并实时监测正畸骨吸收的活性。据我们所知，该探针是首次将Hcy的强抗干扰能力和Asp6对宿主骨无潜在危害的优点设计用于骨吸收检测。通过系统的体外光学性能、骨靶向能力和细胞毒性试验，我们发现该探针具有灵敏度高、光稳定性好、可逆性好、抗干扰性强、骨结合能力好、生物相容性好等特点。更重要的是，体外和体内骨吸收监测试验表明，该探针可以通过荧光成像检测骨吸收，并定量监测与骨吸收相关的pH值。因此，Hcy-Asp6在正畸治疗中具有极大的临床潜力，可用于骨吸收的实时监测，也可作为其他骨吸收相关疾病骨吸收监测的参考。
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