为大家分享一篇发表在JACS上的文章Solid-Phase Compatible Silane-Based Cleavable Linker Enables Custom Isobaric Quantitative Chemoproteomics，本文通讯作者是加州大学洛杉矶分校的Keriann M. Backus助理教授，其课题组主要从事化学蛋白质组学方向的研究。
人类蛋白质组中存在着成千上万可靶向的Cys残基，针对上述残基开发特异性的共价小分子，将能够极大地提高蛋白靶点的可成药性。在已有研究中，Cysteine化学蛋白质组学技术成功赋能多种（不）可逆小分子的发现。目前，该技术的主要挑战是提高Cys残基标记与检测的覆盖度。本文中，研究人员致力于建立一种稳健、简化、经济高效、高通量和高覆盖率的Cysteine化学蛋白质组平台。首先，作者对等重捕获试剂进行了设计与合成。为实现该试剂大量、便宜的合成，作者采取了固相合成的策略，通过酰胺键链接的形式，依次引入生物素、DADPS、叠氮基团、同位素标记。为实现上述设计，作者摸索并建立了DADPS-Fmoc的合成路径，实现了该building block的大量制备，并将最终合成的捕获试剂称为基于硅烷的可切割同位素标记蛋白质组学（sCIP）试剂。为探索sCIP试剂结构对于Cys位点鉴定的影响，作者合成了一系列不同Fmoc-DADPS连接子长度、叠氮基团取代、重标氨基酸的sCIP试剂，并将其用于基于IAAlkyne的Cysteine化学蛋白质组学鉴定。结果表明，上述结构变化对位点鉴定几乎没有影响，并且与传统的基于biotin-azide的鉴定结果基本一致。作者下一步评估了sCIP试剂在MS1定量上的可行性。通过使用含有不同数量重标同位素的sCIP试剂，研究人员证实不同混合比均能得到符合预期的定量结果。随后，作者将该流程用于KB02的靶点鉴定，结果与biotin-azide的鉴定结果基本一致，且高定量比的靶点均为已知KB02结合位点。为将sCIP试剂应用于MS2定量中，作者首先需寻找该试剂在MS2谱图中产生的特征诊断离子。在这里，研究人员使用FragPipe的MSFragger与PTM-Shepherd模块，对上述质谱结果中的诊断特征进行挖掘。基于上述流程检测到的29−40种碎片离子，作者基于离子强度、检测频率进行筛选，最终得到4种在不同sCIP试剂中均存在的特征碎片离子。基于上述结果，作者绘制了sCIP试剂的潜在碎裂模式，并使用MSFragger labile ion模式对上述碎片离子的信号强度、修饰/未修饰谱图中检测频率进行评估，结果表明，由三氮唑处C-N键断裂形成的二氢噁唑（dihydrooxazolium）离子（F2、F6、F10），具有最理想的信号强度、修饰谱图选择性。此外，引入FAIMS模块，能够进一步放大该碎片离子作为诊断离子的潜力。基于上述认知，研究人员在sCIP试剂中引入重标同位素，得到不同的reporter基团，并使用对应的IAAlkyne探针，作为balancer基团，并探究上述流程在MS2定量上的可行性。在对HCD碰撞能量进行优化之后，作者成功实现了六标相对定量。最终，研究人员将上述技术应用于半胱氨酸反应片段筛选，sCIP蛋白质组学结果揭示了已有的和未知的半胱氨酸-配体互作，包括发现线粒体解偶联剂FCCP是一种共价可逆的半胱氨酸反应亲电子体。综上所述，本文建立了基于硅烷的可切割同位素标记蛋白质组学（sCIP）流程，实现了低成本的蛋白质质谱MS1&MS2定量，并将其应用于亲电配体靶点筛选。
本文作者：TZS
责任编辑：TZY
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c05797
文章引用：DOI: 10.1021/jacs.3c05797
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