今天为大家分享一篇2022年4月发表在J. Am. Chem. Soc.上的工作，文章题目是“Exploiting Endogenous Enzymes for Cancer-Cell Selective Metabolic Labeling of RNA in Vivo”。该项工作由加州大学Robert C. Spitale教授完成。在这项工作中，他们设计了“笼状”核苷类似物，该类似物可以通过充当癌细胞特异性酶的底物来激活癌细胞种RNA代谢标记，这将使复杂环境中的肿瘤细胞表达分析成为可能。

追踪RNA表达的化学方法的一个主要限制是无法定向标记感兴趣的细胞类型中的RNA。在以往的RNA代谢标记实验中，通常将化学修饰的核苷类似物添加到细胞中，核碱基/核苷类似物的化学修饰使它们对内源性代谢途径“惰性”，而特定代谢酶的表达可以控制它们的掺入。迄今为止，大多数研究都依赖于外源酶的过表达来控制代谢掺入。然而，这种方法依赖于外源酶的表达，这需要费力的程序来产生表达构建体。此外，活体动物的使用需要耗费大量时间。

在这篇工作中，作者首次使用内源性酶来控制RNA的代谢标记。他们介绍了一种新型代谢报告基因的合成和表征，该报告基因仅在癌细胞中代谢整合到RNA中。癌细胞具有特异性的酶表达和活性，可以控制细胞的生长和代谢。例如，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)在癌细胞中高度过表达和过度活跃，以控制基因表达。组织蛋白酶是另一类众所周知的在癌细胞中过度表达的酶，特别是转移性癌症，以控制细胞外基质的降解并为随后的转移提供上皮-间质转化。癌细胞的这些独特的酶特征已被用于前药方法，但尚未用于代谢标记。

图1. RNA细胞特异性代谢标记

在这篇工作中，作者设计了修饰核苷酸类似物Lys-2’N3A。Lys-2'N3A被设计成一个与门响应性核苷，需要HDAC和组织蛋白酶L蛋白酶(CTSL)来“解开”N-6保护基团释放2'N3A。接下来作者使用细胞内筛选测定来确定Lys-2'N3A是否会优先掺入癌细胞RNA中。简而言之，Lys-2'N3A在癌细胞或非癌细胞的培养基中以1 mM浓度孵育24小时。使用CuAAC和炔烃生物素收集和生物素化总RNA。使用斑点印迹评估生物素化。他们筛选了癌细胞和非癌细胞系。如图2b和c所示，他们没有在非癌细胞系中观察到高于背景的RNA掺入。相比之下，他们观察到癌细胞系中不同程度的掺入，高侵袭性癌症MDA-MB-231和MCF7（转移性乳腺癌）、PC3（胰腺癌）或肺（LS174T）具有非常高的RNA掺入率。作者还使用生物正交成像来更好地展示代谢标记方法的细胞特异性。作者使用了癌性(MDA-MB-231)和非癌性(HEK293T)细胞，观察到Lys-2'N3A即使在共培养情况下也没有掺入非癌细胞RNA中。这些结果进一步证明了癌细胞标记Lys-2'N3A的细胞选择性。

图2. Lys-2'N3A对细胞内RNA代谢标记

最后作者还建立了MDA-MB-231细胞的体内异种移植肿瘤模型。他们对小鼠进行2'N3A或Lys-2'N3A的腹腔注射，使用CuAAC采集器官并成像。他们在注射Lys-2'N3A的动物的肿瘤中观察到明亮的荧光，在相同动物的肝脏内有轻微的信号。与此形成鲜明对比的是，他们在注射2'N3A的动物的肿瘤和许多器官中观察到荧光。最后，他们用RNase处理了两只动物的肿瘤切片并观察到信号的显着损失，这表明信号源自RNA标记。他们从器官中分离总RNA并将分离的总RNA进行生物素化，然后通过斑点印迹分析。如图3g所示，RNA生物素化谱与成像实验中观察到的相似。总体而言，这些结果表明这个策略可以在体内使用RNA的细胞选择性代谢标记来选择性地标记肿瘤。

图3. 体内细胞特异性RNA标记成像

总的来说，这篇工作展示了复杂环境中RNA代谢标记的新化学方法，证明了内源性酶可用于控制代谢标记并实现精细的细胞选择性。通过共培养系统不仅在体外而且在体内也证明了特异性，以高选择性地标记肿瘤细胞。这种方法可以扩展到活体动物不同疾病或特定器官背景下的其他酶，并用于转录组范围的分析。

【文章链接】

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c02404

【DOI号】

https://doi.org/10.1021/jacs.2c02404

【参考文献】

1. Gupta, M.; Singha, M.; Rasale, D. B.; Zhou, Z.; Bhandari, S.; Beasley, S.; Sakr, J.; Parker, S. M.; Spitale, R. C. Mutually Orthogonal Bioconjugation of Vinyl Nucleosides for RNA Metabolic Labeling. Org. Lett. 2021, 23 (18), 7183– 71872.

2. Jao, C. Y.; Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008, 105 (41), 15779– 84.

3. Kubota, M.; Nainar, S.; Parker, S. M.; England, W.; Furche, F.; Spitale, R. C. Expanding the Scope of RNA Metabolic Labeling with Vinyl Nucleosides and Inverse Electron-Demand Diels-Alder Chemistry. ACS Chem. Biol. 2019, 14 (8), 1698– 1707.

【本文作者】

   王玉琴

   黄硕课题组博士后