2019年7月10日，美国佛罗里达州斯克里普斯研究所化学系、分子医学系的Ben Shen课题组在Journal of the American Chemical Society杂志上发表了题为Characterization and Crystal Structure of a Nonheme Diiron Monooxygenase Involved in Platensimycin and Platencin Biosynthesis（参与平板霉素和平板素生物合成的非血红素双铁单加氧酶的性质和晶体结构）的文章。第一作者：Liao-Bin Dong和Yu-Chen LiuDOI: 10.1021/jacs.9b06183
非血红素双铁单加氧酶组成了一个快速增长的加氧酶家族，在次生代谢中很少被发现。在此，作者报道了一种非血红素双铁单加氧酶PtmU3的结构特征，它在平板霉素和平板素统一的生物合成中安装了C-5β-羟基，这两种高度功能化的二萜类化合物对细菌和哺乳动物脂肪酸的合成酶起到了有效的和选择性的抑制作用，并且这种羟基化为随后的A环裂解奠定了基础，是独特的平板霉素和平板素二萜类衍生骨架的关键。TIM-barrel骨架是自然界中发现的最常见的蛋白质结构折叠，由8个重复βα基序组成，八股平行的β-折叠形成桶的内壁，并被α-螺旋包围。超家族中的大多数特征酶是醛缩酶、糖苷酶、烯醇化酶和金属依赖水解酶。迄今为止，没有金属依赖的加氧酶被归类于TIM-barrel结构的拓扑级水平，包括非血红素双铁单加氧酶。非血红素双铁单加氧酶家族的特点是在活性部位含有一个非血红素双铁中心来激活分子氧，其催化的典型酶反应包括甲烷羟基化、脂肪酸脱饱和、脂肪醛脱甲酰化和芳烃羟化等，另外，也有少量可参与到次生代谢产物的生物合成。到目前为止，只有三种酶作用于两种天然产物骨架上，其中两种参与氯霉素的生物合成：CmlA催化L-对氨基苯丙氨酸(L-PAPA)的β羟基化；CmlI催化六电子氧化芳胺为氯霉素骨架中的芳基硝基官能团(Figure 1A)。第三种酶是来自金链菌素生物合成机制的AurF，它类似于CmlI，它催化六电子的N-氧化，但是与CmlI作用的底物不同(Figure 1A)。CmlI和AurF的结构类似于几乎在每个非血红素双铁单加氧酶中发现的四螺旋束折叠，而CmlA的结构特殊，包含这个家族特有的金属-β-内酰胺酶折叠。平板霉素(Platensimycin，PTM)和平板素(platencin，PTN)是从平板链球菌中分离出来的两个高度功能化的细菌二萜类化合物，它们是细菌和哺乳动物脂肪酸合成酶的选择性抑制剂，有望成为抗菌和抗糖尿病治疗的药物先导。从结构上讲，PTM和PTN由两个不同的部分组成，一个是3-氨基-2，4-二羟基苯甲酸，一个是脂肪酮内酯，二者通过一个酰胺键连接(Figure 1B)。作者先前从可同时产生PTM和PTN的S.platensis CB00739菌株中克隆并测序了ptm基因簇。鉴于PTM和PTN及其晚期同系物中保守的C-5酮基，A环的C-4/C-5键的逆醇醛环裂解后的C-5羟基化被认为是PTM和PTN生物合成中最有趣的结构转变之一(Figure 2A)。在这里，作者描述了PtmU3的鉴定和性质，它是一种非血红素双铁单加氧酶，在PTM和PTN的生物合成中扮演着一个关键缺失步骤的角色，揭示了一个新的非血红素双铁羟化酶超家族的第一个成员。
Figure 1. Nonheme diiron monooxygenases in secondary metabolism. (A) Nonheme diiron monooxygenases discovered in chloramphenicol and aureothin biosynthesis. (B) Structures of PTM and PTN as well as their thioacid derivatives, thioPTM and thioPTN, produced by the engineered overproducer S.platensis SB12029. The aliphatic ketolide and 3-amino-2,4-dihydroxybenzoic acid moieties of PTM and PTN are highlighted in blue and red, respectively.
Figure 2. Characterization of PtmU3 as a C-5 β-hydroxylase. (A) Unified pathway for PTM and PTN biosynthesis, featuring enzymes with promiscuity acting on both the ent-kauranol-derived PTM and the ent-atiserene-derived PTN scaffolds. The C-19 carboxylic acid is activated in the form of CoA esters by PtmA1 and PtmA2. PtmU3 then catalyzes C-5 β-hydroxylation (highlighted in red), which sets the stage for the ensuing Aring cleavage at the C-4/C-5 bond via a retro-aldol reaction. In ΔptmU3 mutant strain SB12050, the nascent products of CoA esters 7 and 11 are isolated in free acid forms 5 and 9 due to spontaneous hydrolysis during isolation and purification. Compound 13, a precursor of 5, can also be isolated from SB12050. (B) HPLC analysis of crude extracts, with total ion current detection, of ΔptmU3 mutant strain SB12050 (ii) with engineered PTM and PTN overproducer SB12029 serving as a positive control (i). (C) HPLC analysis, with UV detection at 260 nm, of in vitro PtmU3-catalyzed reactions with 7 as a substrate. (D) HPLC analysis, with UV detection at 260 nm, of in vitro PtmU3-catalyzed reactions with 11 as a substrate.
为了确定催化PTM和PTN二萜类骨架的生物合成基因，作者首先灭活SB12029中ptm基因簇中功能未知的剩余基因，该类基因参与PTM和PTN双重生产，以SB12029菌株为阳性对照，将得到的突变菌株在标准条件下发酵。C-5羟化被认为发生在酮内酯的CoA硫酯化之后和A环裂解之前，如果此猜测正确，由于辅酶A连接的中间产物的水解，相关突变体的发酵图谱有望与ΔptmA1突变体的发酵图谱相似。通过HPLC分析，ΔptmU3突变体的代谢物图谱符合这一预期(Figure 2B和S3)，表明ptmU3可能参与C-5的羟基化。ptmU3被认为是一种编码金属依赖的氨基水解酶基因，这个超家族由许多酶组成，它们均含有TIM-barrel结构的折叠，但是迄今为止，还没有从这个超家族中鉴定出羟基酶。
Figure S3. Southern analysis of the ΔptmR1/ΔptmU3 double mutant S. platensis SB12050.二、PtmU3参与C-5β的羟基化依赖铁离子的存在PtmU3的体外特性证实了它是一种铁离子依赖的酶，在PTM和PTN的生物合成中负责C-5β的羟基化。为了证实PtmU3确实是负责C-5羟化的单加氧酶，作者克隆了ptmU3并在大肠杆菌中进行了异源表达，并对表达的PtmU3蛋白进行了纯化。首先，PtmU3直接以平板霉素 ML17(7)或Platencin ML4(11)作为底物共同孵育，但经高效液相色谱分析，没有明显的产物形成(Figure 2C，D)。考虑到PtmU3需要金属离子的催化才能发挥活性，故又添加了一定催化量的Fe2+，并以抗坏血酸作为化学还原剂，以煮沸的PtmU3为对照，分别与底物7或11孵育后观察到一个新的峰(8或12，Figure 2C，D)。高分辨质谱分析表明，8和12的相对分子质量分别为1098.307Da和1082.312Da，比底物7和11高16Da，表明化合物中增加了一个羟基。虽然Fe2+是该反应的首选催化离子(计算结果为100%)，但其他二价阳离子也可催化PtmU3的反应：Mn2+(41.1%)、Co2+(35.4%)和Cu2+(1.6%)。尽管锌离子经常作为相关的氨基水解酶超家族的辅助因子，但在有锌离子或EDTA存在的情况下却没有观察到产物。三、PtmU3结构中饱和的M1中心可能发挥结构性作用而非催化作用鉴于PtmU3催化的独特化学成分和无法初步预测其生物信息学活性，作者着手表征PtmU3的结构，以更深入地了解其催化机理。与尺寸排阻色谱分析法结果一致，PtmU3结构由不对称单元中的两个多肽链(A链和B链)组成。PtmU3的整体结构包括C末端的典型TIM-barrel折叠和一个存在于N末端结构域的小三链反平行β-折叠组成，两侧还存在两个α-螺旋(Figure 3A)。虽然TIM-barrel结构是自然界中发现的最常见的折叠，约占所有蛋白质的10%并催化各种酶反应，但数据显示，PtmU3是第一个以TIM-barrel羟化酶为特征的酶。两个金属离子(晶体结构中的锰)位于PtmU3β-Barrel中心的顶部，并与七个残基(Asp10、His12、His189、Glu241、Asp308、His311和Glu313)和一个水分子的侧链配位(Figure 3B)。这两种金属离子之间的距离为3.8 Å(相对于之前的双铁酶来说，其正常范围为2.7-4.8 Å)。这两种金属离子与残基和（或）水形成六配位，形成扭曲的八面体几何构型，距离从2.0 Å到2.5 Å不等，Glu241和Asp308是两个金属离子中心之间的桥联配体。诱变研究表明，Glu241结构是必需的，而E241A突变体完全失去了酶活性，表明金属离子对PtmU3的功能至关重要。为了PtmU3结构中所具有的饱和铁离子中心(M1中心)，作者类似地产生了D10A、H189A和D10A/H189A突变体，但没有获得可溶性蛋白，可能是因为M1所起的是结构性的作用而不是催化作用。无论利用一个金属中心还是两个金属中心进行催化，这个饱和的M1中心都成为了该酶与其他双铁单加氧酶的区别所在。对双铁芳胺加氧酶AurF和CmlI的详细机理研究表明它们都利用两个铁离子来激活过氧基中间体，然而，金属中心的组织使得这种机制对PtmU3来说不太可能。还有其他只使用一种铁离子来催化氧活化的双铁酶：肌醇加氧酶MIOX和有机磷酸氧化酶PhnZ。然而，在这两种酶中，第二种铁离子被用来结合它们各自的底物，这一作用显然没有被PtmU3中的M1所填补(Figure 3)。因此，突变、结构数据和文献先例的结合均提供了证据，表明M1可能发挥结构性作用，而不是催化作用。作者接下来揭示了PtmU3与底物7和11复合的结构，以进一步探索活性部位以及底物和酶之间的相互作用。这两种底物在活性中心采用相似的取向，为PTM和PTN的立体特异性C-5β羟基化提供了结构基础(Figure 3A)。Leu93和Ile190与ent-kauranol、ent-atiserene部分疏水相互作用，与CoA部分产生强相互作用。这两种底物结合结构表明，新的N-末端结构域的主要作用是为CoA提供结合位点，Arg52(位于N末端结构域)和Asn208分别与CoA的β-丙氨酸和泛酸区域的两个酰胺羰基形成氢键(Figure 3C，D)。
Figure 3. Crystal structures of PtmU3. (A) Overall structure of the PtmU3 monomer. PtmU3 is composed of a small N-terminal domain (yellow) and a C-terminal TIM-barrel fold (green). (B) Nonheme diiron center in PtmU3. Two metal ions are coordinated with the side chains of seven residues (three His, two Asp, and two Glu) and a water molecule (yellow dashed lines). (C) Active site of PtmU3 complexed with 7. (D) Active site of PtmU3 complexed with 11. The active sites of PtmU3 complexed with 7 and 11 are very similar. The two substrates (7 and 11) align well and are depicted in cyan and magenta, respectively. The two metal ions are shown in purple. The distances between the two metals or water and C-5 of 7 and 11 are shown as orange dashed lines. Hydrogen bonds are shown as brown dashed lines. 2Fo−Fc electron density maps of substrates 7 and 11 contoured at 1σ are depicted with a gray mesh, and thus PtmU3 likely represents the first characterized member of a new superfamily of enzymes utilizing a TIM-barrel fold.
虽然PtmU3代表该簇的第一个特征酶，但BLAST搜索显示所有同源物的蛋白质序列与PtmU3的同源性>50%。除了两个来自α-变形杆菌的同源物外，其余的同源物都来自放线菌。较低的分类多样性可能是PtmU3及其同系物近期进化的标志，可能是从酰胺水解酶进化而来的。所有同源物都有七个负责结合双铁中心的保守残基(三个His、两个Asp和两个Glu)，如PtmU3，而负责结合CoA的残基似乎也是广泛保守的(Arg52、Arg53、Arg200和Asn208)。
Figure 4. Broad distribution of PtmU3-like nonheme diiron monooxygenases in nature. (A) Sequence similarity network (SSN) of PtmU3-like proteins in bacteria. A BLAST e-value threshold of 10−90was employed. Colors represent different bacterial phylogenetic classes. The cluster containing 142 PtmU3-like nonheme diiron monooxygenases is circled. (B) Subnetwork of putative PtmU3-like nonheme diiron monooxygenases from (A) with a BLAST e-value threshold of 10−140 (median 53% sequence identity). Six clusters and four singletons were separated when the evalue threshold of 10−140 was used. The corresponding accession numbers are listed in Table S6. PtmU3 and its homologue from the PTN pathway, PtnU3, are depicted as red triangles.
在本文中，作者证实了PtmU3是一种安装C-5β羟基的非血红素双铁单加氧酶，在PTM和PTN的生物合成中发挥重要的作用，合成过程中A环的C-4/C-5键的断裂，为提供特征的脂肪族酮内酯部分奠定了基础。在结构上，PtmU3采用了一个前所未有的具有新型CoA结合N-末端结构域的TIM-barrel结构折叠，是TIM-barrel折叠金属依赖氧化还原酶新超家族的第一个特征成员，广泛存在于放线杆菌中。PtmU3具有一个饱和的非规范活性部位结构：M1中心，可能起结构作用而不是催化作用。随着对TIM-barrel折叠结构了解的深入，并依据其连接底物的特异性，通过二价金属阳离子的催化作用，理论上可生物合成更多的天然二萜类产物，今后通过对各种酶类结构的研究，发现其作用机理，或许可为我们实验室的生物合成途径提供一个新的选择，以及提高产物的产量。
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