今日分享的文章是武汉大学胡斌教授课题组于2021年12月发表在ACS Appl. Mater. Interfaces 上的一篇文章，研究人员建立了以AuNPs为元素标记的MB-DT多组分核酸酶(MNAzyme)系统，用于ICP-MS高灵敏定量检测miRNA-155，论文标题为“DNA Tetrahedron-Based MNAzyme for Sensitive Detection of microRNA with Elemental Tagging. ”

miRNAs是一类具有 18-25个核苷酸的内源性非编码 RNA，miRNAs的异常表达会导致生物体细胞异常增殖和凋亡并与许多疾病密切相关。因此，它们可以用作疾病早期诊断的生物标志物。目前为了提高miRNAs定量分析的灵敏度，通常引入了信号放大技术，如滚环扩增（RCA）、核酸外切酶辅助扩增， 催化发夹自组装（CHA），杂交链式反应（HCR）， 链置换反应（SDR）和脱氧核酶（DNAzyme）。ICP-MS 方法能够对 miRNA 进行定量分析，对样品基质具有良好的耐受性，并能够同时分析多个检测对象，在基于 ICP-MS 的元素标记生物测定中，通过DNA 功能化磁珠 (MB) 的异质检测被广泛用于 miRNA 的检测，而近年来DNA四面体（DT）具有尺寸均匀、性能稳定、制备/改性简单等特点其用于信号调节的能力受到越来越多的关注，本文工作主要构建 MB-DT-AuNP 探针以介导 MNAzyme 信号放大，并开发一种简单且高灵敏度的 ICP-MS 方法，用于以 Au NPs 作为元素标记对 miRNA-155 进行定量检测（其方法原理如图所示）。

Sub-AuNP探针的制备

通过用硼氢化钠还原氯金酸制备小粒径的金纳米粒子，将总共 10 μL 的 100 μmol L ^-1底物添加到 1 mL 制备好的 Au NPs 溶液中，并在室温下放置过夜。然后，每5分钟添加20 μL的2.5 mol L ^-1 NaCl 溶液，以将基底修饰到 Au NPs 的表面。将NaCl溶液在强烈涡流下缓慢滴入混合物中，混合物中NaCl的最终浓度约为 0.2 mol L ^-1。将混合物在室温下保持 16 小时后，以 14000 转/分的速度离心30分钟。将获得的Sub-AuNP探针用由 Tris-HCl、NaCl 和 Tween-20 组成的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重新悬浮在 500 μL TBST 缓冲液中。

MB-DNA探针的制备

DNA四面体(DT)的制备：用TE缓冲液将ssDNA-A/B/C/D分别稀释至 100μmol L^–1 ，每条ssDNA取10μL与210μL TM buffer混合，使每条链的最终浓度为4μmol L^–1 。混合溶液在95°C水浴中加热退火5分钟后迅速冷却至4°C得到DT。

MB-DT探针：将120μL的10 m g m L^–1  SA-MBS用1 m L的由TBST buffer和TBS buffer混合液洗涤三次，然后再分散在 600 μL 的TBS buffer中。随后，加入 15 μL的 4 μmol L^–1  DT，将混合物在 37 °C 下孵育 60 分钟并轻轻摇动，通过链霉亲和素和生物素之间的特异性结合修饰 SA-MB 表面的 DT。

MB-ssDNA探针：为了进行比较，将 20 μL用生物素修饰的 10 μmol L^–1 单链 DNA（链 E）与 100 μL 10 mg mL^–1  SA-MB 混合，并将混合物在 37 °C 下孵育 60 分钟。轻轻摇动以制备 MB-ssDNA 探针。

MB-DT-AuNP探针的制备

将200 μL的Sub-AuNP 探针以8500 rpm的速度离心5分钟，以去除大颗粒或团聚颗粒。然后将上清液与 150 μL的2 mg mL ^–1  MB-DT 探针混合，并在 37 °C 下在恒温振荡器中反应 3 小时。在用 200 μL TBST 缓冲液洗涤四次和用 200 μL TBS 缓冲液洗涤一次后，将获得的 MB-DT-AuNP 探针重新分散在 150 μL TBS 缓冲液中。通过使用 300 μL 的 2 mg mL ^–1 MB-ssDNA 探针代替 MB-DT 探针，进行相同的步骤以获得用于比较的 MB-ssDNA-AuNP 探针。

ICP-MS检测miRNA-155

基于 MNAzyme 和ICP-MS对带有元素标记的miRNA-155进行定量检测，将15 μL的 2 mg mL ^–1  MB-DT-AuNP 探针、4 μL的1 μmol L ^–1  部分酶 A、4 μL 的 1 μmol L ^–1 部分酶B 和 12 μL 100 mmol L^-1 Mg ²⁺与含有不同浓度目标 miRNA 的溶液或真实样品混合，反应体系总体积为80 μL。经37 ℃反应3 h后，将混合溶液磁分离，取上清液60 μL导入ICP-MS进行Au的检测。

Sub-AuNP 探针和 MB-DT 探针的表征

TEM 图像显示制备的 Au NPs 的尺寸分布，制备的金纳米颗粒呈球形，粒径均匀，平均直径约为 5 nm（下图为TEM图像）

下图显示了 Au NPs 和 Sub-AuNP 探针的 UV-vis 光谱。Au NPs 与底物偶联形成 Sub-AuNP 探针后，其最大吸收峰从 514 nm 转移到 526 nm。MB-DT 探针的 zeta 电位测量和粒度表征的实验结果如下图。可以看出，在用 DT 修饰 SA-MB 以形成 MB-DT 探针后，SA-MB 的 zeta 电位从-13.0 变化到-31.3 mV，这些结果表明 Sub-AuNP 探针和 MB-DT 探针的成功制备。

可行性分析

研究人员通过PAGE对DNA单链、双链和四面体表征图显示成阶梯条带，以此证明DT的成功制备。为了评估所提出的基于 DT 的 MNAzyme 系统的可行性，获得了不使用 Au NPs 的 DT 和 MNAzyme 系统的电泳图。下图（A）泳道 1-5 分别对应部分酶 A、部分酶 B、靶 miRNA、MNAzyme 的底物和末端序列可以与底物部分杂交的 DT，泳道6显示DT和底物的反应产物；泳道7 和 8 分别为没有和有靶 miRNA 的 DT 和 MNAzyme 的反应产物。可以看出，第6泳道有DT存在时底物条带消失，说明底物与DT杂交；与泳道 7 中的条带相比，在泳道 8 中出现了新的条带，表明底物在完整的 MNAzyme 系统中被切割，包括靶 miRNA、部分酶 A/B、底物和辅因子，以上结果证明了DT-MNAzyme体系的成功构建。此外，用Sub-AuNP探针代替基板，利用ICP-MS检测研究MB-DT-MNAzyme系统的可行性。使用 Mg²⁺和 Mn²⁺的辅因子分别观察到明显的信噪比 (S/N) 为 17.5 和 9.6。证明了在靶miRNA-155存在的情况下，MB-DT-AuNP探针释放出Au NPs，表明基于MB-DT的MNAzyme系统构建成功。

MB-DNA-AuNP探针的制备

研究人员为了评估 DT 在构建 DNA 功能化 MB 中的功能，平行制备 MB-DT-AuNP 探针和 MB-ssDNA-AuNP 探针进行比较。在制备MB-DNA-AuNP探针时，对SA-MBs与生物素修饰DNA的比例和Sub-AuNP探针的体积进行了详细优化。

SA-MBs与生物素修饰DNA的比率：SA-MB 与生物素修饰 DNA 的比例在1/15–1/500 g nmol ^–1 范围内变化，SA-MBs/生物素修饰的DT和 SA-MBs/生物素修饰的ssDNA的最佳比例分别为 1/50 和 1/200 g nmol ^–1 ；

Sub-AuNP 探针的体积：当使用的 Sub-AuNP 探针的体积在 MB-DT 组中从 1 增加到 20 μL 时，Au 的信号强度增加，然后随着 Sub-AuNP 探针的量进一步增加到 30 μL，Au的信号强度略有下降。在MB-ssDNA组中，Au信号强度先增加，然后当使用超过10 μL的Sub-AuNP探针时，Au信号强度出现显着降低；

MB-DNAAuNP探针上功能DNA链的密度

用F链与荧光基团偶联代替Sub-AuNP构建MB-DT和MB-ssDNA探针，并通过荧光光谱法测定探针上F链的数量。发现 MB-DT 和 MB-ssDNA 探针上功能性 DNA 的密度分别为每毫克 MB 38 和 60 pmol。MB-ssDNA探针上功能性DNA链的密度约为MB-DT探针上的1.6倍，负载在MB-ssDNA-AuNP探针上的Au NPs密度约为MB-DT-AuNP探针的1.4倍，与荧光检测得到的结果吻合较好。

方法的特异性

研究人员设计了一系列与目标 miRNA 错配的单碱基、双碱基或三碱基序列和非互补序列。它们用于替换目标 miRNA-155 并进行实验程序，如通过 ICP-MS 检测 miRNA-155部分所述，对构建的基于MB-DT-或MB-ssDNA的MNAzyme系统的特异性进行了评估，由下图可看出错配碱基组和非互补组获得的Au信号强度远低于实验组，表明基于 MB-DT 或 MB-ssDNA 的 MNAzyme 系统都对具有高序列相似性的miRNA 具有良好的特异性。

方法的分析性能

通过绘制Au的信号强度与从 0 到 20 nmol L ^–1 变化的 miRNA-155 浓度，建立了 miRNA-155 的校准曲线，在MNAzyme系统中使用MB-DT-AuNP探针获得的miRNA-155的LOD比使用MB-ssDNA-AuNP探针获得的LOD低约23倍，线性范围较后者更宽。系统。此外，通过将目标 miRNA-155 的浓度固定为 1 nmol L ^–1 ，基于 MB-DT 的 MNAzyme 系统获得的信噪比为 51.8，高于使用 MB-ssDNA-AuNP 探针获得的信噪比35.3。

研究人员制备了一种基于生物素修饰的 DT、SA-MB 和 Sub-AuNP 的 DNA 功能化磁性探针。此外，还构建了基于 MB-DT 的 MNAzyme 扩增系统，用于通过带有元素标记的 ICP-MS 快速灵敏地定量 miRNA-155，与传统的ssDNA功能化MBs相比，DT在构建DNA功能化MBs时有效地控制了MBs表面Sub-AuNP探针的密度，有利于MNAzyme更高的切割效率和更低的LODs，此外，MNAzyme 扩增与 MB-DT 的整合避免了复杂的解吸和洗脱步骤。所开发的MB-DT-MNAzyme-ICP-MS方法非常简单，灵敏度高，选择性好，对生物基质具有耐受性，在miRNA分析中表现出良好的应用潜力。