分享一篇2022年发表在JACS上的文章，题目是“Harnessing Dual-Fluorescence Lifetime Probes to Validate Regulatory Mechanisms of Organelle Interactions”。文章的通讯作者为广西大学的Weiying Lin教授。真核细胞中的膜结合细胞器并不作为孤立的实体发挥作用，而是在细胞内形成以协同方式执行生理功能的“社交网络”。细胞器之间的相互作用，包括运动、连接和重塑，无处不在，几乎每个细胞器都与其他细胞器非常接近。各种细胞生理机制通过细胞器之间的串扰通路进行精细调节，并且它们的失调与不同的病理状况有关。然而，破坏这些相互作用会导致多种神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病和各种其他疾病。为了全面、系统地理解疾病的发病机制和治疗方法，深入研究细胞器相互作用至关重要。然而，缺乏同时标记具有双重不同信号的两个细胞器的时间分辨分子工具阻碍了研究人员准确表征纳秒级相互作用调节机制的能力，从而导致细胞命运研究的障碍。LIM是一种时间分辨方法，用于映射显微图像中纳秒级激发态寿命的空间分布。荧光寿命的分析能够基于时间相关的单光子计数机制同时收集和区分所有荧光寿命，从而为标记物的准确定位提供更高的检测效率。内质网 (ER) 是最大的亚细胞器，在复杂的网络中跨越细胞质并执行基本的细胞功能，例如蛋白质折叠和运输、类固醇生物合成和钙储存。ER-phagy 是一种处理途径，其靶向 ER 结构域并将它们隔离在自噬体中，以便在缺乏营养时运输到液泡或溶酶体进行降解。自噬体可以从高度动态的管状 ER 网络的膜中产生，该网络控制细胞和降解细胞器中的主要分解代谢途径。观察内质网 (ER) 和自噬体之间的相互作用调节机制需要细胞内部环境中的非侵入性、实时和可区分的信号以及高时间和空间分辨率。在这项研究中，作者提出了一种时间分辨策略，使用单个荧光探针响应膜张力产生双荧光寿命，期望使用 FLIM 成像在纳秒时间尺度上实现相互作用调节机制的双信号成像。在这项工作中，作者努力在不同的细胞内细胞器中实现膜张力响应双荧光寿命，主要集中在调节分子转子的旋转以在推拉 π 共轭系统中检测膜张力（方案1A）。在此，作者介绍了响应膜张力的推拉式探针CF s（CF1、CF2和CF3 ）。如图1 B所示，探针CF1中的推挽系统由电子接受部分“4-hydroxy-7-diethiamino-coumarin”和供体单元“indoline”在 π 共轭系统中桥接而成. 然后，为了研究推拉系统中接受能力的变化是否可以调节荧光寿命，将强吸电子基团-BF 2负载到 4-hydroxy-7-diethiamino-coumarin 上形成CF2结构. 作者的目标是确定灵敏的双荧光寿命探针，通过调节推拉系统中电子受体的吸电子能力来响应膜张力，揭示 ER/自噬体中新的细胞器相互作用调节机制（方案 1 C）。图1 用 5 μM CF s 染色的单相 GUV 中的 FLIM图像。为了评估不同吸电子受体对二氢吲哚分子转子旋转的影响，利用CF s 通过不同种类的单相 GUV 的 FLIM 成像直接监测荧光寿命。GUV，包括 Ld GUV（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱：DOPC）和 Lo GUV（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/胆固醇：DPPC/CL 和鞘磷脂/胆固醇: SM/CL), 是按照温和水合法制备的。其中，已知胆固醇插入 Lo 相，填充由 DPPC 或 SM 双键产生的自由空间，并增加脂质排序和膜张力。此外，考虑到CF1和CF2的不同亲水和疏水能力，选择两亲性 SM GUV 和亲脂性 DPPC GUV 作为脂质有序微区。如图 1所示， CF1和CF2在 DPPC/CL 或 SM/CL GUV 中的荧光寿命通常高于 DOPC GUV，这主要与双分子层膜张力增加有关胆固醇。然而，基于推拉系统中与供体相同的二氢吲哚分子转子，不同的吸电子受体影响了CF1和CF2的平均荧光寿命范围响应脂质排序和膜张力。如图 1 A、B所示，Lo 和 Ld GUV 中CF1的平均荧光寿命几乎全部出现在伪彩色青色中，对应于 1.312–1.742 ns 范围内较短的荧光寿命。如图1 C、D所示，由 DOPC GUV 组成的 Ld 微域中的 CF2 主要出现在伪彩色青色中，对应于 1.134 ns 的较短荧光寿命。值得注意的是，CF2在由 DPPC/CL 组成的 Lo 微区或 SM/CL GUV 中的 2.590 ns 中，表现出一种伪彩色黄色，对应于 3.195 ns 的更长荧光寿命。为了进一步验证CF2探针的吸电子效应，作者分别探索了 SM 和 SM-CL GUV中CF1和CF2的荧光寿命变化。这些结果表明，由于-BF 2基团的强吸电子能力，CF2的荧光寿命比CF1对脂质排序更敏感。这些结果表明，CF2在不同的微环境中具有显著变化的荧光寿命。图2 用 5 μM CF2 染色的混合相 GUV 中的 FLIM图像。考虑到CF2可以通过两种不同的荧光寿命来区分Lo和Ld相，作者想知道CF2是否可以识别混合相GUVs中Lo和Ld微区的共存，以期实现不同膜张力的同时双荧光寿命成像。因此，准备将 GUV 与由 DOPC/DPPC/CL 和 DOPC/SM/CL 组成的共存 Lo 和 Ld 微区混合，以评估CF2通过 FLIM 同时可视化 Ld 和 Lo 相的能力。如图2所示, DOPC/DPPC/CL 和 DOPC/SM/CL GUV 的 FLIM 图像显示出清晰的分离域，同时具有两种不同的绿色和红色伪色，这与在上面的纯 Ld 和 Lo 相中观察到的相吻合。对于图2A 中的 DOPC/DPPC/CL GUV ，记录了双指数衰减，衰减时间为绿色的τ 1 (0.899 ns) 和红色的 τ 2 (3.087 ns)。同样，它也符合 DOPC/SM/CL GUV 的双指数衰减，其中绿色的短荧光寿命τ 1为 1.066 ns，红色的长荧光寿命 τ 2为 2.342 ns（图 2 B）。此外，CF2的荧光寿命在 DOPC-DPPC-CL (2.369 ns) 中表现出比在 DOPC-SM-CL (1.497 ns) 中更长的时间，表明 DOPC-DPPC-CL 中的膜张力可能高于 DOPC-SM-CL 中的膜张力。此外，如图 2 C 所示，DOPC/DPPC/CL GUV 中白色框感兴趣区域 (ROI) 1 和 ROI 2 的 FLIM 直方图拟合良好且分裂良好，表明CF2具有同时双荧光寿命的能力不同膜张力的成像。然而，如图2D所示，与 DOPC/DPPC/CL GUV 相比，DOPC/SM/CL GUV 中白框 ROI 3 和 ROI 4 的 FLIM 拟合直方图分裂不佳，这主要是由于Ld和 Lo 脂质微区中CF2的荧光寿命相对较近。因此，CF2可以同时标记具有两个不同荧光寿命的混合 GUV，以响应不同的脂质微区，有望用于研究细胞环境中的膜张力。图3 CF2荧光寿命对用 5 μM C F2 染色的 GUV 渗透冲击的响应。为了研究膜张力对CF2荧光寿命变化的影响，作者应用CF2使用混合 GUV（DOPC：DPPC：CL = 2：2：1）检测不同膜张力下的荧光寿命。改变膜张力的常用方法是应用渗透压休克。低渗冲击可导致膜张力增加，而高渗冲击可导致膜张力下降。如图 3所示，当对装载有CF2的 GUV 应用低渗冲击（Π < 0.3 Osm）时，作者观察到低渗冲击比等渗条件下的寿命更长（Π = 0.3 Osm，等于0.9% NaCl 溶液或 4.5% 葡萄糖溶液）但在高渗冲击下更短（Π > 0.3 Osm）（图 3 A、B）。平均荧光寿命 τ i的变化与渗透压 Π ( R 2 = 0.9793) 呈线性关系，随着膜张力的增加而增加。总体而言，平均荧光寿命 τ i对来自培养基的渗透压 Π 的依赖性在两种 GUV 中都是线性的，斜率为 -0.9248 ns Osm –1（图 3C）。平均荧光寿命 τ i与渗透压 Π 成比例的强烈变化表明CF2的寿命与膜张力呈良好线性拟合，可用于监测膜张力的变化。图4 在EBSS孵育 30 分钟下用 5 μM CF2 染色的 3T3 细胞成像。由于自噬体的时空分布受细胞营养状态的准确调控，因此将细胞培养于无血清培养基EBSS中，刺激饥饿条件下细胞内自噬体的过表达，增加细胞内自噬体的含量显着 1 小时。如图4所示A-a1，基于 ER 和自噬体中荧光强度信号的共聚焦图像均发出红色荧光，无法以两种不同的颜色区分它们，并且不利于同时可视化 ER 和自噬体之间的相互作用。与之形成鲜明对比的是，与CF2一起孵育的 3T3 细胞的 FLIM 成像同时显示了 ER 和自噬体中的双荧光寿命（图 4 A-a2）。如图 4 A-a3、a4所示， CF2的荧光寿命符合双指数衰减，以获得平均荧光寿命 τ 1的衰减为绿色 0.702 ns，而平均荧光寿命 τ 的另一个衰减2个红色为 1.834 ns。. 伪彩色绿色代表较短的荧光寿命，清楚地描绘了 ER 的小管和层。伪彩色黄色对应于更长的荧光寿命，这说明了空心球形和新月形自噬体。此外，图S31B显示了细胞中CF2的荧光寿命直方图，表明荧光寿命在缩放ROI 1和ROI 2中的分布范围。如图4所示B，荧光寿命 τ 在 ROI 1 (ER) 中为 1.649 ns，在 ROI 2（自噬体）中为 1.902 ns。如图 4 C所示，在 590-650 nm 的发射范围内收集了 3T3 细胞中 ER 和自噬体的共聚焦 3D 图像，两者之间的荧光强度差异很小，增加了区分难度从空间角度看这两个目标。然而，如图4D和Movie S2所示， CF2的3D FLIM清楚地揭示了 ER 和自噬体的空间分布，这可能提供了从时空角度同时可视化 ER 和自噬体之间相互作用的机会。此外，为进一步验证强吸电子基团-BF 2对细胞荧光寿命变化的调节作用，作者还通过FLIM成像在3T3细胞中测量了CF1的荧光寿命。考虑到上述所有结果，CF2通过 FLIM 实现了 ER 和自噬体的同时双荧光寿命成像，具有高分辨率，可以用作可视化它们之间相互作用的潜在工具。图5 用 25 μM 顺铂孵育的 3T3 细胞中 ER 和自噬体的 FLIM 成像。为了研究自噬在与 ER 应激相关的细胞凋亡过程中的作用，CF2用于通过 FLIM 观察细胞凋亡过程中顺铂诱导的 3T3 细胞中 ER 和自噬体之间的相互作用。如图5所示A，在顺铂刺激1小时的过程中，可以清楚地观察到空心球形自噬体和网状内质网的形态，自噬体均匀分布在管状内质网区域周围。随着孵育时间增加到 5 甚至 15 小时，自噬体的数量急剧增加，内质网断裂成短棒状或球状。24小时后，细胞完全凋亡，自噬体与内质网融合形成空心囊泡（ROI 1和ROI 2的白色箭头），发生内质网自噬。ROI 1 中 1.590 ns 的荧光寿命和 ROI 2 中同一空心囊泡中 1.829 ns 的荧光寿命符合图 5 B，从而能够量化 ER 和自噬体的融合。此外，平均荧光寿命τ i随着顺铂的孵育时间增加（图5C）。此外，随着顺铂孵育时间的增加，寿命较长的比例逐渐增加，寿命较短的人口相应减少（图5D）。这些结果表明，过长和强烈的 ER 自噬导致自噬体与 ER 融合，从而促进 ER 相关的自噬凋亡途径。总之， CF2的 FLIM 成像在 3T3 细胞中揭示了在顺铂诱导的细胞凋亡途径中，ER-phagy 参与了细胞凋亡过程，这可能为药物开发提供新的靶点。综上所述，作者提出了一种时间分辨策略，用于开发能够同时对两个细胞器进行双信号成像的双荧光寿命探针，并揭示了纳秒时间尺度的细胞器相互作用调节机制。本文描述的荧光寿命探针以及未来基于时间分辨策略开发的各种探针将作为时间分辨工具得到重要应用，以努力实现对细胞器相互作用的全面理解，并将阐明神经生长和退行性疾病的治疗。原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.2c08966
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