介绍一篇来自ACS chemical biology的文章“Visualization of Ectopic Serine Protease Activity by Forster Resonance Energy Transfer-Based Reporters”。文章的通讯作者是来自俄勒冈健康与科学大学的Carsten Schultz教授。他主要关注开发细胞通路的成像工具。蛋白酶是细胞生命活动过程中不可缺少的蛋白。检测蛋白酶的活性一直是一个重要的研究课题。之前有很多研究直接用带有荧光的底物肽段来检测活性。最近也有研究开发了基于活性的共价探针通过共价作用将带有底物的探针连接在酶上。而本篇文章则引入了基于空间距离的FRET,将其与底物进行连接来测试蛋白酶的活性。
本篇文章研究的蛋白酶是通道激活蛋白酶(CAP),这些蛋白酶会切割上皮钠离子通道使其彻底被激活。在囊性纤维化疾病中,这一过程的过度激活是主要的病因,因此对CAP家族酶活的检测是十分重要的。为了动态地检测CAP酶的活性,本文在酶底物肽段上连接了两个荧光基团,结合FRET进行检测。之前已经开发过了类似的探针,他们首先延长了底物肽段的长度,将其变为RQARVVGG。CAP家族蛋白大部分定位在膜系统上,因此在膜表面对其活性进行检测更为重要。本文进行的第二处改进就是对探针进行脂化改造,使其能够插入到细胞膜上,在底物被酶切割后,水溶性的荧光分子会脱落,信号会产生变化。根据之前的经验,文章选择Cou343作为水相的荧光分子,而另外的一个荧光分子除了水溶性的MeOCou外选择了包含TAMRA的4个脂溶性的荧光分子。
在合成了这些荧光探针后,文章在体外对其进行了测试,两个都采用水溶性荧光基团的CARPee1可以在水相体系内检测CAP3的酶活,但是不能在脂溶性体系内检测。剩余四个分子中带有PEG的TAMRA分子的CARPee3探针效果最好,CARPee5则完全没有效果。之后文章尝试在鼠源和人源的细胞内检测酶活,其中CARPee3探针的效果依然是最好的。
文章接下来确认了各个探针对于CAP家族的选择性。他们使用各种重组蛋白酶并用探针试图检测它们的活性。他们发现CARPee系列探针能够很好的检测CAP家族的活性,但是存在一些非特异的靶标。最后他们在囊性纤维化模型细胞内对CAP酶活性进行了检测,发现酶的活性确实增高了。总而言之,文章开发了一种可以实现在膜表面定量检测CAP家族酶水解活性的FRET探针,这一探针在囊性纤维化疾病的治疗领域有一定的应用价值。
本文作者:LZH
责任编辑:LDY
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.1c00168
文章引用:10.1021/acschembio.1c00168
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