来源：英国biorbyt
荧光标记技术起源自20世纪40年代，当时使用荧光标记抗体来检测相应的一些抗原。随着分子生物学、现代医学的发展以及各种先进荧光检测技术及仪器的应用，荧光标记作为一种新的、非放射性的标记技术受到人们很高的重视，并取得了极为迅速的发展，继而广泛应用在了细胞内外的物质检测、核酸的检测与疾病早期的诊断等，在生物学研究领域以及医学研究领域里发挥了重要的作用。
荧光，又叫做“萤光”，是指一种光致的发光现象。当某些常温的物质经过某种波长入射光的照射之后，吸收光能将跃迁到激发态，然后通过振动弛豫、内转化等现象达到第一激发态，随即在激发态停留大约10-8S之后，能够跃迁至基态，常常伴有随光的辐射，这里发出的光也就是荧光。利用荧光标记分子，将其共价结合在一些分子识别物质（比如酶、抗原/抗体、DNA、适配体、多肽等）上作为探针，分子识别物质与被检测的对象（比如蛋白、多肽等）进行反应之后，根据荧光标记分子在反应前后的荧光强度变化，对被检测对象进行各种定量的分析。荧光标记分析法，即一种生物的分析方法，它以荧光物质作为标记物。根据所使用的一些分子的识别物质（比如酶、抗原/抗体、DNA、适配体、多肽等）的不同，可以分为荧光免疫的分析法、基于DNA杂交的荧光分析方法、基于适配体的荧光分析法、基于多肽的荧光分析法等。荧光标记试剂也就是提供荧光体的试剂。在荧光标记的技术中，最常用的试剂有罗丹明类和荧光素类等，其它的荧光标记试剂，还有多环芳烃的化合物、芳香杂环的化合物类以及一些稀土元素的螯合物等，近期发展起来的某些新型的荧光标记试剂，同样也受到很大程度的重视。Fluorescein 标准荧光素之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。荧光素类的衍生物，有荧光素异硫氰酸、四氯荧光素、羟基荧光素等。它广泛应用于杂交的探针、降解蛋白质的测序以及抗体标记中。FITC-异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，是应用最为广泛的一种荧光素的衍生物，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白质的测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测和荧光能量激发转移测试。
FAM-羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP，也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。TET-四氯荧光素，Tetrachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。 TET以及HEX均是在FAM基础上加以改进的，氯原子使FAM的Abs与Em值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pH敏感性。TET也适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=521/536nm 。 TET，HEX，FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP，HEX用于标记d/ddGTP或d/ddATP荧光素类标记试剂的主要结构之中，因为苯环上有比较大的羧基，使得芳香环保持于和生色团垂直的一个位置，使得荧光量子的产率有所提高。但是荧光素类衍生物有也存在一些共同的缺点：比如pH 的敏感性较强、光淬灭率较高、发射波谱较宽等。
R 110-标准荧光素之一,在其基础上进行结构改造,即可产生一系列罗丹明类衍生物。与Fluorescein类衍生物相比，罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性，更高的荧光产量以及更低的pH敏感性。罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸，但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭，故大多数不适宜用于标记蛋白。R110被用于DNA自动测序。
TAMRA-羧基四甲基罗丹明，Carboxy tetramethyl rhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，6- TAMRA被广泛使用。 TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的，6- TAMRA适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0），6-TAMRA（NHS）常用于荧光标记试剂盒中。 6- TAMRA主要用于DNA自动测序中。TRITC-四甲基异硫氰酸罗丹明,tetramethyl rhodamine isothiocyanate。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。经常和FITC一起在双标记实验中使用，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
罗丹明类试剂的主要结构中R2、R3均为活性基团，主要是—NCS、—SO2X 等基团。在标记反应当中，活性基团大多将与—NH2结合。Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤玻片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强的发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC，在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤玻片。Cy3在氩光灯（514nm或528nm）下可以被激发出50%的光强，在氦氖灯（543nm）或者汞灯（546nm）下则约75%。Cy3可以和荧光素一起做双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。
Cy5耦联基团激发光的最大波长为650nm，发光波长最大为670nm。在氪氩灯（647nm）下他们可被激发出98%的荧光，在氦氖灯（633nm）为63%。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适的激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大吸收波长为566nm，最大发射波长为574nm。藻红蛋白具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰，具有极高的发射量子产率，具有非常高的水溶性，而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。
PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。还有一些荧光标记试剂包括：多环芳烃吲哚、萘、蒽、芘等，芳香杂环化合物吖啶、香豆素、菲锭类等，镧系稀土的螯合物，藻红素N、哌洛宁、色霉素A3等。其中吲哚、哌洛宁、色霉素A3主要就是用来标记生物核酸。以上传统的荧光试剂一直以来应用很广，但也存在着或多或少的缺陷，比如光漂白现象（可能导致了荧光的信号不稳定）。另外，传统生物分子的荧光标记法，只能连接少数几个荧光分子于生物分子的活性基团之上，分析的灵敏度很有限。近年来，纳米级荧光探针的问世，为生物标记打开了新的发展领域。纳米荧光具有（1）激发的光谱宽，（2）连续的分布，（3）发射光谱分布对称而且宽度窄，（4）颜色可调节等优点。
常见荧光标记物的激发光和发射光波长
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