分享一篇发表在ACS central science上的论文，文章的通讯作者是Scripps研究所的Benjamin F. Cravatt教授和他课题组的博士后Vincent M. Crowley，他们课题组主要致力于化学蛋白质组学相关领域的研究。本论文首先证明了功能化Scout片段可以作为位点特异性的靶标结合探针，然后在此基础上开发了ELISA-ABPP的方法，有望作为共价配体发现与优化的平台。
传统的化合物高通量筛选主要针对纯化的靶点进行筛选，对于难以表达纯化的靶点或者具体功能不清的靶标蛋白，该方法具有一定的局限性。然而ABPP技术可以在整个蛋白质组中通过测定化合物库中小分子对活性探针标记靶蛋白的影响，从而筛选和优化蛋白质的小分子抑制剂，但是基于质谱技术的分析方法由于分析时间较长，通量较低，因此限制了筛选化合物的数量。因此，本文建立了一个应用更加广泛的筛选方法—ELISA-ABPP，针对难以纯化或者功能不清的目标蛋白质，从更大的亲电化合物库进行位点特异性分析。作者最初考虑使用IA探针来开发配体优化平台，但IA探针具有广泛的反应性，该属性使其不适用于目标蛋白中单个半胱氨酸残基ELISA-ABPP分析。作者使用亲电性的“Scout”片段作为蛋白质上半胱氨酸位点的选择性探针, 荧光胶的结果也表明与IA-alkyne的标记相比，反应性更低的KB02yne and KB05yne探针的标记强度要弱很多，有趣的是，在较低的标记浓度(0.5μM)下，三种探针表现出相似的反应活性，并显示出与高浓度标记显著不同的标记pattern。这种位点特异性相互作用可能在较低的探针浓度下最为明显，因为在较高探针浓度下与其他半胱氨酸的反应可能会掩盖这种特异的相互作用。接下来作者使用高、低浓度的三种探针处理细胞，基于MS的蛋白质组学来鉴定高反应活性的位点，值得注意的是，其中在一些蛋白中，IA不同浓度标记的ratio要比scout 片段探针高得多，表明了scout片段的位点特异性的反应。作者进一步对鉴定出的特异性位点进行突变，结果表明scout片段敏感的Cys突变消除了大部分的标记，而其他Cys的突变不会实质上改变scout片段的反应性。
接下来，作者建立了一种ELISA-ABPP的高通量筛选方法，首先在细胞中表达FLAG表位标签标记的蛋白靶点，其细胞裂解液分别与亲电化合物文库与DMSO孵育，然后与生物素化的位点特异性探针(KB02/ KB05-biotin)孵育，并转移到链霉亲和素包被的微孔板上，被探针标记的蛋白代表没有与亲电小分子结合的蛋白，他们会被吸附在平板上，经过清洗后，平板与抗FLAG-HRP抗体孵育，再次清洗后与HRP底物处理产生有色物质，通过简单的比色法来筛选共价小分子抑制剂。作者进一步通过比较位点特异性探针与WT和C-to-A突变体的反应性来验证ELISA-ABPP分析的准确性，结果表明，对探针敏感的Cys突变消除了大部分的标记，与Gel-ABPP的结果一致。
进一步，作者选择NADPH依赖的还原酶AKR1B10作为用ELISA-ABPP高通量筛共价小分子抑制剂的实例，作者从138个亲电小分子文库中筛选到VC59和VC63，他们能抑制探针对AKR1B10的标记超过80%，此外，作者还利用ELISA-ABPP计算了VC59、VC63以及未经过改造过KB02的IC50值，结果显示二者的抑制活性比KB02提高了30倍。接下来，作者使用Competitive-ABPP的方法完成了VC59对探针in vitro和in situ标记的影响，令人惊讶的是，VC59对in vitro的标记有明显的竞争，对in situ标记的竞争作用几乎消失。作者猜想VC59与AKR1B10的in situ反应性降低可能是由于该蛋白在活细胞的状态发生了改变。并且也通过实验证明了AKR1B10-C299与KB02yne反应性可被NADPH浓度的增加所阻断，这表明AKR1B10可能完全与细胞内的这一辅因子结合，从而减缓或阻止细胞内C299的亲电化合物反应。
总之，本文使用了位点特异性的探针，建立了一个应用更加广泛的筛选方法ELISA-ABPP, 从而实现对更大的亲电化合物库进行位点特异性的高通量筛选。
本文作者：ZJ
责任编辑：WQW
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acscentsci.0c01336
文章引用：10.1021/acscentsci.0c01336
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