北京大学化学与分子工程学院陈鹏教授在J. Am. Chem. Soc.上发表了题为“Copper-Triggered Bioorthogonal Cleavage Reactions for Reversible Protein and Cell Surface Modifications”的研究论文。在这篇论文中，作者在蛋白质和完整的细胞上建立了一种生物正交释放反应来实现对蛋白质和细胞结合时间和可逆性的控制。通过对过渡金属催化生物正交裂解反应的系统研究，发现Cu(I)-BTTAA和双取代脯氨酰(DsPra)或丙氧羰基(DsProc)等铜配合物为小分子药物、蛋白质侧链和完整的细胞表面提供了一种生物正交释放对，能可逆地阻断和保留初级胺和酚醇。作者使用Cu(I)-BTTAA/dsProc和Cu(I)-BTTAA/dsPra对作为“无迹连接”策略，构建可切割的抗体-药物结合物(ADC)，在原位释放细胞毒性化合物，并作为细胞表面工程的“可逆修饰”策略。此外，通过与遗传密码扩展策略的耦合，实现了在活细胞膜上定点调节配体-受体相互作用。本文的工作将过渡金属介导的生物正交切割工具包从末端降解扩展到内部断裂，为治疗蛋白和细胞提供了一种可逆的共轭策略。

机理图，可逆蛋白质和细胞表面工程中的铜触发生物正交切割反应：(a，b) 生物正交可切割的ADC，用于在肿瘤细胞上原位释放细胞毒性有效载荷；(c) 可逆细胞表面修饰；(d) 特异性位点的可逆突变，以精确调节细胞表面配体-受体的相互作用。

图一，过渡金属催化生物正交裂解反应的系统筛选。(a) 将过渡金属介导的生物正交键裂解反应从末端笼闭基团的去保护转移到破坏内部共轭连接键。(b) 以香豆素为基础的荧光测定法，检测不同dsProc和金属催化剂组合的生物正交性和切割效率。笼状香豆素衍生物的荧光猝灭，去除笼闭基团后可重新激活，得到未经修饰的香豆素(ex=380 nm，em=450 nm)。(c) 采用香豆素荧光报告法对过渡金属催化剂和丙氧羰基作为生物正交裂解对进行了高通量筛选。结果显示，在催化生物正交点击反应时均具有良好相容性的三种含铜(I)配合物(C1-C3)，观察到较高的荧光恢复率。相反，钯配合物(C5-C7)的切割效率较低，而其他金属物种则几乎没有切割。同时，在筛选到的不同取代基中，二甲基取代dsProc的切割反应活性最高，在30 min (DMProc，1C)内可获得>95%的荧光。值得注意的是，简单的铜盐（例如CuSO4 /抗坏血酸盐）无法触发切割反应，从而强调了金属配体在促进此类转化中的重要性。

图二，Cu(I)-BTTAA/DMProc切割对实现ADC的生物正交裂解：使用DMProc作为一种无迹linker来产生可切割的ADC，从而允许在肿瘤部位以生物正交和无痕方式释放毒性有效载荷。(a) 通过铜触发的生物正交裂解反应使肿瘤细胞上Dox-DMProc-Z_HER2无痕释放并激活Dox的示意图。DMProc同时充当笼蔽基团，以阻止Dox活性，并作为内部liner将Dox与Z_HER2亲和体偶联。(b) 可释放ADC Dox-DMProc-Z_HER2的结构。(c，d) 用LC-MS分析监测cu(I)-BTTAA触发去除DMProc的情况。大部分的Dox-DMProc在大约1小时内被降解，其次，通过细胞分析发现添加50 μM Cu(I)-BTTAA可使Dox-DMProc的IC50降低120倍。即，Cu(I)-BTTAA能有效地触发Dox-DMProc的降解，恢复细胞环境下Dox的毒性。(e) Z_HER2过表达的癌症细胞系SKBR-3表明，Dox的毒性有效地被DMProc-Z_HER2缀合封闭，且向Dox-DMProc-Z_HER2中添加Cu(I)-BTTAA可将其毒性恢复到与未经修饰的Dox相当的水平。(f) Dox-DMProc-Z _HER2在SKBR-3细胞上的的荧光图像。已知Dox进入细胞后会插入双链DNA，在细胞核中可观察到明亮的荧光。相反，Dox-DMProc-Z_HER2主要聚集在细胞表面，而荧光主要在膜区域观察到。如所期望的，Cu(I)-BTTAA的添加容易释放游离Dox，其在细胞质和细胞核内产生明亮的荧光。

图三，铜介导的DsPra脱保护释放的酚也可用于开发含酚药物的可裂解ADC。铜触发的生物正交切割Etop使之从Etop-EMPra-Z_HER2无痕释放并活化的示意图。

图四，利用Cu(I)-BTTAA/DMProc对实现细胞表面可逆修饰。(a)铜控制细胞可逆修饰的原理图。将生物素与DMProc-PNB偶联到A 375细胞表面，允许随后的FITC标记的链霉亲和素结合。由此，FITC有效地引入到细胞表面，在细胞膜上产生明亮的荧光。Cu(I)-BTTAA引发的生物正交裂解可以以类似的方式释放FITC，FITC荧光在1 h内几乎完全消失。鉴于生物素-链霉亲和素系统的广泛适应性，通过使用文中的生物正交可释放linker和反应，各种有效负载可以可逆地附着在细胞表面或从细胞表面分离。在细胞表面成功地实现了可逆修饰，这表明该切割反应在细胞的可逆捕获中具有巨大的应用潜力，在肿瘤细胞诊断中有很大的应用价值。

图五，基因编码的生物正交切割反应用于细胞表面蛋白质相互作用的位点特异性调控。(a) 通过遗传编码的策略将化学笼状非天然氨基酸（ncAA）特异地掺入目标蛋白质中，在化学降解后可以将其恢复为原始氨基酸。(b) 化学笼状非天然氨基酸DMProcK（DMProc笼闭的赖氨酸）和EMPraY（EMPra笼闭的酪氨酸）的结构。(c)通过基于GFP的高通量筛选测定法鉴定的DMProcK和EMPraY识别PylRS变体上的突变位点。获得了两个能识别EMPraY(A302T，N346A，C348A，V401L，W417A)和DMProcK(Y384F)的突变体。(d) 铜触发的含DMProcK或EMPraY的蛋白质体外化学切割效率。DMProcK和EMPraY分别在残基N149处与GFP结合生成GFP-N149-DMProcK和GFP-N149-EMPraY蛋白。通过LC-MS分析监测了蛋白上的切割反应，有效地获得了对应切割产物GFP-N149-Y和GFP-N149-K的MS峰，表明Cu(I)-BTTAA的催化活性高于Cu(I)-BTTP和Cu(I)-BTTPS，两种蛋白质的切割效率均超过70％。(e) Z_HER2和HER2之间的结合可以通过在其界面之间残基(如K8、R11、K28或Y36)上的位点特异性结合DMProcK或EMPraY而被阻断。通过将Z_HER2-TAG-TAMRA突变体相对于Z_HER2-WT-TAMRA的荧光强度标准化来计算相对结合活性。将所有带有位点特异性掺入的DMProcK或EMPraY的荧光标记Z_HER2变体与SKBR-3细胞孵育并通过流式细胞仪进行分析，观察到荧光信号的减少。加入Cu(I)-BTTAA处理后，不同Z_HER2突变体的荧光恢复程度差异很大，Z_HER2-K28DMProcK的荧光恢复率最高。这表明，笼蔽的K8，R11和Y36残基导致Z_HER2-HER2相互作用的显着减弱，可在Cu(I)-BTTAA触发的切割后有效恢复。相反，笼蔽K5和R33只能部分阻断HER2和ZHER2之间的相互作用，而笼蔽K50和K51残基则不会干扰相互作用，这表明与Z_HER2-HER2界面上其余残基相比，这些残基到Z_HER2-HER2接口的位置更远。(f，g) 将荧光标记的Z_HER2与SKBR-3细胞孵育，通过流式细胞仪监测到强烈的荧光增强。而在添加Cu(I)-BTTAA后，该荧光信号实际上保持不变，表明Z_HER2和细胞表面上的HER2受体之间建立了强相互作用。接下来，将Z_HER2-K28DMProcK与SKBR-3细胞孵育观察到荧光信号的减少且荧光峰在很大程度上与未处理的细胞重叠，表明通过化学残基进行的化学笼蔽几乎完全阻断了Z_HER2和HER2之间的相互作用。加入Cu(I)-BTTAA处理后，Z_HER2-K28DMProcK结合效果达到了与野生型Z_HER2相似的水平。利用Z_HER2-K28DMProcK与Cu(I)-BTTAA触发器，可方便地与HER2高表的细胞表面连接和分离，为可逆地靶向毒物或成像试剂到肿瘤细胞表面而提供了一种方便的工具。

总之，作者开发了一种依赖于Cu(I)-BTTAA / dsProc或Cu(I)-BTTAA / dsPra对的新的生物正交切割反应，用于暂时阻断和恢复氨基或酚基，适用于蛋白质、细胞和有效载荷之间的内键断裂。对蛋白质和细胞结合时间和可逆性的控制具有巨大的应用潜力，可在肿瘤部位无迹释放抗体-药物结合物(ADC)，以及按需改变或去除细胞表面的靶向元素，拓展了生物正交切割反应工具包的用途和治疗应用。

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.9b05833

陈鹏

北京大学教授，研究兴趣主要集中在化学与生物学的前沿交叉领域，试图通过化学家的知识与手段，为生命科学的探索提供一系列崭新的工具和研究方式。具体研究方向如下：

蛋白质工程，蛋白质特异标记，蛋白质药物化学；

临床感染性病菌与人体免疫系统相互作用的机理研究；

面向生物活体内的化学反应与技术；

基于蛋白质的金属离子及有机小分子生物传感器的开发与应用。