【Angew Chem】一种脱氢氨基丁酸的化学探针

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细菌苏氨酸磷酸裂解酶(或磷酸裂解酶,phospholyases,)是一类毒力因子家族,能够不可逆地催化β-消除磷酸化苏氨酸(PThr)或丝氨酸(PSer)残基中磷酸,生成脱氢氨基丁酸(Dhb)或脱氢丙氨酸(Dha)。细菌在侵染细胞后,可利用苏氨酸磷酸裂解酶通过β-消除ERK1/2活化环(ERK1/2activation loop)上的pThr而使丝裂原活化酶(MAPK)信号失活,从而减弱先天免疫反应。此前,塔夫茨大学的Prof. Rebecca Scheck课题组研究确定,相较于PSer,磷酸裂解酶更倾向于PThr,因此Dhb的研究对于磷酸解酶活性的全局分析是至关重要的。

以往的报道中,在生物相容的条件下,亲核基团,特别是硫醇与αβ-不饱和官能团的Michael加成比较容易发生,并已经应用于修饰细胞中含Dha的蛋白质。然而迄今为止,只有少数报道使用了Michael加成来标记含有Dhb的蛋白或肽。值得注意的是,这些方法都需要较高的pH(10-13)/或高温(50-90℃)来加速反应。然而,磷酸化或糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基很容易经碱催化发生β-消除,从而产生Dha以及Dha综上,由于缺少生物相容性的方法来选择性富集Dhb修饰的蛋白质,磷酸水解酶底物的鉴定仍然具有挑战性。近期在Angew Chem.上,Scheck课题组报道了一种亲核膦探针,它能够在生物相容性条件下选择性地标记哺乳细胞裂解物中Dhb修饰的肽和蛋白质。

 

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1.细菌磷酸解酶催化从含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的蛋白质消除磷酸,生成的脱氢丙氨酸(DHA)或脱氢氨基丁酸碱(Dhb)结构可以被亲核探针标记。

 

为了确定巯基-Michael加成是否能够应该用于DhaDhb的多肽和蛋白质的修饰,Scheck课题组首先对比了β-巯基乙醇(βME)分别标记含有DhaDhbERK1/2活化环 [H-GFL-Dha-EyV-NH2(A)H-GFL-Dhb-EyV-NH2(B)]。在相同的条件下,肽A能够被定量标记,但是只能观察到微量肽B的标记产物。作者推断可能是由于Dhb上甲基的空间位阻和超共轭使得其亲电性低于Dha,表现出了对脂肪族硫醇加成的抵抗力。随后,作者们继续评估了一组亲核试剂与肽B之间的反应,同样,无论是巯基化合物还是其他的亲核试剂均不能有效地对肽B进行标记(2)

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2.在肽A(靛蓝)和肽B(青色)与一系列亲核试剂(A,半胱胺;B2-巯基乙醇;C,苄胺:D,吡咯烷;E,咪唑;F4-乙氧基苄胺;G,苯胺)在温和条件下的反应。通过LCMS评估转化率。


基于以上实验以及最近报道的TCEP((2-羧乙基))αβ-不饱和酰胺的Phospha-Michael加成反应(J. Am. Chem. Soc.2018, 140, 14, 4757-4760)Scheck课题组选择使用TCEP对上述的两种肽进行标记。在孵育24小时后,两种肽都能够实现定量修饰(3-C)。作者测定了肽A的膦加成反应的二级速率常数(k=2.6×10-1M-1s-1,发现在相同条件下,它比与硫醇加成反应(k=5.2×10-3M-1s-1)快约2个数量级。这表明Phospha-Michael反应在动力学上是有利的,与以前的报道一致。众所周知,膦类化合物相对于硫醇具有更强的亲核性,并且经常被用作催化剂,特别是在MichaelBayliss-Hillman反应中。此外,与βME(pKa=9.6)相比,TCEP具有更低的pKa(pKa=7.6),因此更适合于近中性pH下的反应。此外,TCEPDhb底物反应的二级速率常数(k=2.5×10-3M-1s-1)和巴豆酰底物的二级速率常数(k=6×10-4M-1s-1)相似。因此,这是迄今为止报道的第一个能够在生物相容性条件下修饰含Dhb物种的反应,且TCEP修饰后产物表现出良好的稳定性。

 

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3.A) βME()TCEP()修饰含DhaDhb的肽(A、肽B)B) βME隔夜孵育后,肽A被定量修饰;C) TCEP隔夜孵育后,肽A和肽B均被定量定量修饰。

 

为了在细胞环境中利用该反应,Scheck课题组合成了生物素化巯基化合物(1)、生物素化膦(2)两种探针(4-B),用于检测A431细胞中的磷酸裂解酶产物。A431,人表皮鳞癌细胞,能够过表达表皮生长因子(EGF)受体,表现出包括ERK1/2在内的下游激酶的结构性激活。当A431细胞裂解物被福氏志贺氏菌的重组OspF(一种磷酸化酶)处理之后,作者观察到与磷酸化的ERKK1/2相对应的信号完全丧失。随后,作者将裂解产物暴露于探针12(1mM);当用探针2处理裂解产物时,出现了符合预期分子量的生物素化条带(4-C,红色箭头)。随后用免疫沉淀证实ERK1/2OspF的蛋白靶标。该实验表明,探针2可以修饰细胞裂解物中含有Dhb的蛋白,而探针1不能。此外,探针1对细胞蛋白的非特异性标记远远超过探针2,表明膦探针对其预期的蛋白靶标(Dhb修饰蛋白)具有更高的选择性。

 

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4.A) 活化的ERK1/2,经由OspF处理后得到Dhb修饰的蛋白,随后用亲核探针进行标记;B)探针12的化学结构;C) A431细胞裂解物在OspF处理后用探针12标记。ERK1/2OspF处理后产生Dhb,可被探针2修饰。(*表示与探针无关的α-生物素抗体的非特异性条带)

 

如图4-C所示,作者推断在没有OspF的情况下观察到的背景信号,可能是由于探针2修饰内源性αβ-不饱和亲电体所致(据报道,探针2已经被用来检测蛋白质赖氨酸巴豆酰化)。所以作者决定使用组蛋白H3——一个众所周知的赖氨酸巴豆酰化的靶标,进行同样的实验。在没有OspF的情况下,没有发现H3下拉现象,因此表明在实验条件下,内源性的巴豆酰化背景可以忽略。在同时使用OspF和探针2的情况下,作者观察到H3强烈的下拉信号(5-A)。结果预示,磷酸化的组蛋白H3OspF的直接靶标。

 

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5.Western Blot分析±OspF±探针2处理的A431 细胞裂解液A) 以及裂解液的免疫沉淀样品B)。。在同时用OspF和探针2处理的泳道,有ERK1/2和组蛋白H3的富集;仅用探针2,未能观察到H3条带。

 

综上,Scheck课题组报道了一种可以在生物相容条件下检测含有Dhb的肽或蛋白质的亲核膦探针。该探针有助于鉴定新的磷酸裂解酶靶标,分析细菌感染的生物标志物,以及开发酶介导的生物正交标记策略。

 

相关链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202003631

Prof. Dr. R. A. Scheck课题组:

https://chem.tufts.edu/faculty/scheck/


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