来自ACS chemical biology，题目是Identification and Mobilization of a Cryptic Antibiotic Biosynthesis Gene Locus from a Human-Pathogenic Nocardia Isolate.

     诺卡氏菌属包含超过50种人类致病性物种，可导致一系列疾病，从皮肤和软组织感染到肺和脑感染。然而，尽管诺卡氏菌属于最重要的次级代谢产物产生菌（放线菌）家族，但对诺卡氏菌，特别是引起人类感染的诺卡氏菌，产生次级代谢产物的能力还没有得到很好的研究。利用基因组挖掘技术研究了诺卡氏菌的隐性次生代谢物生物合成基因簇，并在人致病株Nocardia brasiliensis和Nocardia vulneris 中鉴定了一个保守位点。链霉菌寄主的直接捕获和异源表达激活了生物合成位点，揭示了它是brasiliquinone、苯并蒽醌类抗生素的来源，其生物合成途径一直隐藏了20多年。这篇文章报道了这些被忽视的人体致病性诺卡氏菌是多种重要天然产物的来源。

    细菌感染宿主并引起疾病的能力是几千年来人类发病率和死亡率的基础。放线菌是最大、种类最多的一个细菌科，它含有引起这种疾病的病原体，包括分枝杆菌属、棒状杆菌属和诺卡氏菌属。在诺卡氏菌属的75种报告物种中，超过50种具有致病潜力，可在免疫能力强的宿主和免疫功能低下的宿主中引起皮肤、肺、脑和播散性感染。该属引起疾病的能力及其与链霉菌的密切关系，1889年首次发现了著名的生物活性次级代谢物（SM）产生动力（Nocardia farcinica），直到最近，诺卡氏菌才被认为是生物活性短链菌的潜在来源。小规模基因组研究表明，这些细菌具有与链霉菌相抗衡的次生代谢潜力，然而，这些预测的生物合成位点绝大多数仍然是隐秘的。

    随着基因组测序数据的涌入，比较基因组学现在通常被用来显示细菌之间的联系和定义保守的基因位点。这种比较基因组策略可应用于在一个称为基因组挖掘的过程中寻找短链信息。事实上，已经开发了一些生物信息工具，其目的是协助新短链信息的生物勘探。这些工具还可用于显示次级代谢物生物合成基因簇（SMBGCs）的保守性在细菌群中，尽管SMBGC的存在并不总是与相应代谢物的产生相关。这主要是由于在标准的实验室培养条件下，许多SMBGCs 在其原寄主中的转录潜伏期，这使得将鉴定出的化合物直接归因于其同源位点变得困难。已经开发了几种克服抑制的策略机制和激活转录沉默的BGCs，包括使用直接克隆和异源表达。最新的这些方法利用高度重组的酵母酿酒酵母在适当的穿梭载体中“捕获”长DNA片段，然后将其转移到能够产生次级代谢物的异源宿主。这种方法称为转化相关重组（TAR）已成功应用于一系列BGCs，包括芳香族聚酮化合物，是一组由多种临床有用成分组成的化合物，包括抗生素四环素和抗癌衍生物表阿霉素，尽管II型聚酮合酶（PKS）BGCs（负责芳香族聚酮的生产）可以通过序列数据来确定，但目前还不能通过生物信息学的方法预测所产生的分子。同样，如果不了解产生位点，所鉴定的芳香族聚酮类化合物就不能与其同源基因簇相关联。虽然已知诺卡氏菌产生了几种芳香族聚酮类化合物，但II型PKS-BGCs在该属内的分布以及获得所产生化合物的可能性目前尚不清楚。

     这篇文章中利用基因组挖掘技术对诺卡氏菌属的II型PKS景观进行了调查，并鉴定了保存在人类病原体诺卡氏菌（Nocardia brasiliensis）和瓦氏诺卡氏菌（Nocardia vulneris）基因组中的II型PKS-BGC。采用系统方法，用TAR克隆并在异源宿主中表达了这一保守区，并证明该位点负责产生一类苯并蒽醌类抗生素brasiliquinone的产生，其生物合成途径在近20年中一直处于隐蔽状态。这篇文章表明，人类病原菌是发现生物活性的一个被低估的资源，提供了一种有效的方法来克服在病原菌中操纵大基因簇的困难。

   从DNA序列数据中识别芳香族聚酮BGC的能力，再加上之前关于其在诺卡氏菌中产生的报道，以及致病性诺卡氏菌种类产生这些分子的未知程度使作者探索诺卡氏菌基因组以识别II型PKS BGC。使用AntiSMASH分析GenBank中所有可用的诺卡氏菌基因组，以及几个内部完成的诺卡氏菌基因组是否存在II型PKS-BGCs，显示50个基因组包含65个II型PKS-BGCs。为了研究诺卡氏菌菌株中这些BGC之间的相似性，通过使用BiGSCAPE，进行了全对全基因聚类比较，得到了一个II型PKS-BGC网络。该网络显示，虽然这些基因座中的几个在不同的诺卡氏菌物种中是保守的，但还有一些不太常见，只在一个诺卡氏菌基因组中发现。此外，对该网络的检查表明，仅在人类致病性诺卡氏菌菌株中发现了几个子网络（图1）。有趣的是，这些基因簇中的大多数与MiBiG数据库中的任何smbgc都不匹配，表明这些系统具有生物新颖性，因此可能具有化学新颖性。

  II型PKS基因簇编码一系列离散的酶，这些酶通常位于同一位置并反复浓缩丙二酰辅酶a构建基，然后进行环化和进一步修饰以产生最终产物。CLF是芳香族聚酮类化合物生物合成的关键，通常被认为是聚酮类化合物链长的守门人。先前的研究表明，CLF蛋白质根据其形成的线性聚酮类化合物链的长度而聚集，因此，对预测的诺卡氏菌CLF蛋白进行了氨基酸比对，并推断出最大可能的系统发育树（图1B）。来自所选诺卡氏菌II型PKS-BGCs的假定CLFs覆盖了从C16到C30的一系列潜在链长，预测有大量的CLFs产生C16-C18线性前体。证实了它们的相关性，在基因相似网络中连接的bgc经常出现在同一个分支中（图1）。在某些情况下，单子与连接在子网络中的BGCs在同一个系统发育分支中出现，这表明虽然CLF相似性可以推断出具有相似链长的产物，但不能用来推断出类似的BGC组织、基因含量或必然的终产物。这一分析还表明，一些诺卡氏菌II型PKS-bgc不符合预测的链长，可能代表这些clades向未知分子的延伸，也可能与目前不可预测链长的多酚有关。

      对系统发育分析的进一步分析表明，只有来自人类致病性诺卡氏菌和vulneris诺卡氏菌菌株的II型PKS-bgc组成了两个子网络和分支（图1）。作者从包含clade的C20，TcmI中选择II型PKS BGC进一步分析，发现它们高度共通，基因含量非常相似（图2）。在这个基因簇中，除了酮合酶α（KSα）外，芳香族聚酮生物合成所需的CLF和酰基载体蛋白（ACP）是另外39个开放阅读框，总共约55kb，被预测编码各种氧化酶、转移酶、调节器和转运体，以及一组可能参与糖基化的基因（图2）。由于其在人类致病性芽胞杆菌和外阴芽胞杆菌菌株中的高度保守性，作者试图鉴定该位点可能的多酚产物。在一系列不同的培养基和培养条件下培养乳杆菌代谢物，但未能鉴定出任何芳香聚酮的化合物。作者通过异源表达的基因组，并利用酵母中的转化相关重组（TAR）将完整的55kb区域克隆为单个DNA分子。此策略以前曾用于从链霉菌、盐孢菌和其他细菌中克隆SMBGCs，并涉及构建一个酵母-大肠杆菌链霉菌穿梭质粒，该质粒具有与目标基因簇末端同源的“捕获钩”。该质粒还含有从大肠杆菌到链霉菌的结合转移的用于利用该策略，获得了20个酿酒酵母菌落。将该质粒从酿酒酵母转移到大肠杆菌，然后对该质粒（pTPS790）进行测序，结果表明24985-06的BGC确实已被克隆，并且在克隆区域内没有累积突变。质粒pTPS790经接合转移到S. coelicolor M1152，在S. coelicolor染色体上插入24985-06 BGC。

    培养含有24985-06基因簇的S.coelicolor M1152，然后进行乙酸乙酯提取和高效液相色谱分析，发现在430nm处存在一个新的吸收峰（图3）。此峰仅出现在含S.coelicolor M1152/24985-06的宿主中，但不出现在WT M1152菌株中，对该主峰的HR-ESIMS研究表明，分子式为C20H15O5（M/z 335.0915处的[M-H]-M/z 335.0914处的C20H15O5）。通过制备性HPLC纯化化合物，然后通过1D-和2D-NMR光谱进行结构说明，发现化合物为brasiliquinone B（图3）。抗生素多酚brasiliquinoneB先前是从诺卡氏菌IFM 0089中分离出来的，与brasiliquinone A和C有着密切的关系，推测它们都来自同一个支架和基因簇。根据brasiliquinoneB产生位点的身份，作者重新命名了该位点brq，并对其进行了重新研究不同生长条件下乳杆菌AUSMDU00024985的代谢物。然而，对这些HR-ESIMS数据集进行详细分析，寻找准确的brasiliquinoneA和C的质量，却未能识别出任何此类化合物。这表明brq基因座在野生型菌株的标准培养条件下是沉默的，brq基因座的克隆和整合可能会使该系统从乳杆菌的调节障碍中解放出来。

   目前已知brq BGC的产物，利用生物信息学分析预测了致病性诺卡氏菌中 brasiliquinones的潜在生物合成途径。区别于其他苯并蒽醌的两个有趣的结构特征是C3处的一个乙基和附着在brasiliquinone上的罕见的O-糖苷部分L-ristosamine，而绝大多数芳香族聚酮都是以乙酰辅酶A为底物，例如在交替的起始分子处，包括daunorubicin路径通常需要交替的酰基转移酶（AT）和酮合酶III（KSIII）来启动ACP，然后再被KSα作为线性聚酮链的起始结合。有趣的是，在brq位点内有编码KSIII和AT的基因，后者具有AntiSMASH预测的丙酰辅酶a特异性，强烈表明丙酸是brasiliquinonesC3-乙基的来源（图4）。

    糖苷L-ristosamine被用于合成多种具有生物活性的芳香族聚酮类化合物，包括抗癌化合物staurosporine和daunomycin。已经确定了L-ristosamine的生物合成途径，与许多聚酮键合糖苷一样，L-ristosamine的生物合成始于葡萄糖-1-磷酸。从葡萄糖-1-磷酸生物合成L-ristosamine所需的基因存在于brq位点内，表明L-ristosamine是通过进化保守的途径生物合成的。从异源表达菌株中产生缺乏L-ristosamine的brasiliquinoneB，结合brq位点内存在的L-ristosamine生物合成途径基因，表明 brasiliquinoneA和B具有相同的生物合成来源，外源寄主S.coelicolor M1152的糖苷相关基因沉默。这一点得到了先前从同一致病性诺卡氏菌菌株中同时鉴定出的brasiliquinone A和B。几十年来，人们一直认为链霉菌科腐生土壤细菌是唯一能够产生生物活性短链菌的细菌。然而，基因组学的出现表明，多种细菌谱系，包括人类和动物的病原体，都有可能产生天然产物。这一点可以通过短链菌内酯、皮肤病原体溃疡分枝杆菌的聚酮毒性因子、大肠杆菌素等短链菌群得到证明，一种来自肠出血性大肠杆菌的基因毒素和一系列来自 Klebsiella 和 Pseudomonas的非核糖体肽铁载体。

       系统发育分析说明了诺卡氏菌基因组中II型聚酮合酶BGCs的范围和多样性，表明致病性诺卡氏菌物种具有与其腐生近亲相同的芳香聚酮生产潜力（图1）。分析还表明诺卡氏菌II型PKS覆盖了II型PKS家族树的宽度，在分析的数据集中，65个确定的bgc中有25个是唯一的，而这25个唯一的bgc中有15个只属于致病性诺卡氏菌。这表明有可能从这些生物体中鉴定出大量新的芳香族聚酮类化合物。有趣的是系统发育和网络分析显示，几个诺卡氏菌clf的位置与它们的同源bgc不一致。也就是说，在网络分析中显示高度相关的基因簇不一定具有最密切相关的clf（图1）。考虑到参与芳香族聚酮生物合成的蛋白质数量（酮合成酶、酮还原酶、环化酶、氧化还原酶，偶尔还有糖基转移酶和甲基转移酶），这些酶的不同组合导致了这些多酚的巨大多样性，考虑到单一蛋白质和基因组合的存在与否的分析并不一定一致，这也许并不奇怪。分析还表明，后PKS修饰归因于一个特定的BGC可能独立于链长发生。因此，整个bgc可以根据基因含量进行关联，但它们的clf在序列和预测链长上有显著差异。此外，一些诺卡氏菌clf似乎位于先前确定的链长类的界限之外。只有对这些clf及其同源bgc进行进一步的遗传研究，才能确定这些II型PKS系统是否会产生新链长的芳香族聚酮，或者仅仅是扩展已知分支的边界。

      有趣的是，虽然一些bgc出现在病原菌和腐生植物之间，但两种bgc只在病原菌N.brasiliensis和N.vulneris中发现。尽管以前在诺卡氏菌属中发现了多酚的产生，但18-20没有一种多酚与特定的BGC有关。在这里，作者已经阐明了一种病原体保守的隐秘途径（brq-BGC）的产物brasiliqunones（图3）。有趣的是，即使在连续传代200次后，该位点仍被发现存在于N.brasiliensis HUJEG-1菌株的基因组中，这表明该位点在N.brasiliensis.的生长和维持中具有重要作用，尽管N.brasiliensis和N.vulneris基因组中含有brq位点，在标准培养条件下无法检测到BrasilliensisAUSMDU00024985中的brasiliquinone的产生，这表明该位点在转录上是沉默的。已知的是将brq位点转移到S.coelicolor至少部分消除了brq表达的任何内在调节障碍（图3）。这表明brq调节元件（可能是brq位点、BrqM或BrqV内编码的假定反应调节因子）在S.coelicolor中没有表达或功能受损。无法检测到包含S.coelicolor宿主的BRQ中的brasiliquinone A，这意味着多个控制元件可能负责糖基化基因（brqO、P、Q）和核心PKS生物合成基因（brqA、B、C等）的表达，这些基因编码在相反的DNA链上。作者在这方面的工作已经证实诺卡氏菌是一种次级代谢动力，是鉴定新的生物活性代谢物的一个有希望的来源。事实上，这里使用的方法揭示了SMBGCs的一个病原体特异性分支，并将其同源位点brasiliquinones的产生联系起来。分析还发现了仅存在于诺卡氏菌致病谱系中的其他位点，这些BGCs的产物是否在这些生物体的发病机制中起作用还有待观察。TAR方法或许将有助于破译难以操纵诺卡氏菌物种中沉默位点的产物，同时也为更容易操纵异种宿主的人类病原体bgc研究提供了路线图。