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供稿:陶皖兵,武汉大学
校稿:陶皖兵、陈滢滢、袁必锋,武汉大学
推送:陶皖兵,武汉大学
分享的文献发表在Accounts of Chemical Research上,标题为Harnessing Nature’s Molecular Recognition Capabilities to Map and Study RNA Modifications,通讯作者是美国华盛顿大学化学系Jennifer M. Heemstra教授。 RNA修饰的失调与多种病症相关,包括癌症、自身免疫性疾病以及神经和代谢疾病。RNA修饰与疾病表型之间的功能关系才刚刚开始被理解,而关于RNA修饰在驱动细胞过程中所起的作用,还有很多地方有待研究。解决这些问题需要有效的技术来检测和定位这些RNA修饰位点。在这篇文章中,作者首先介绍了利用抗体来研究RNA修饰的方法,同时总结了化学标记方法中的一些工作。自然界已经进化出大量选择性识别和作用于RNA修饰的酶,这些生物分子的亲和力为该领域提供了一个新方向,作者对此进行了总结与展望。 常用的方法依赖于抗体作为亲和试剂。然而,抗体不易获得,并且通常具有非特异性。修饰碱基和标准碱基之间大小和结构相似,而大部分RNA修饰的丰度相对较低,这些原因使得高靶亲和力和特异性对于核酸检测至关重要。但是,抗体通常在没有进一步靶点验证的情况下使用,这可能导致假阳性结果。例如,针对m1A开发的抗体与m7G之间存在交叉反应。此外,已经尝试使用肌苷-BSA偶联物获得多克隆抗肌苷抗体,但这些抗体与其他核碱基显示出非靶向活性。迄今为止,尚未产生可靠且高度选择性的抗肌苷抗体。由于这些挑战,只有小部分已知RNA修饰存在具有高选择性的有效抗体。 为了规避抗体的这些限制,研究人员试图开发化学方法,利用修饰碱基的独特反应性来实现与标记试剂的选择性反应。例如,RNA用丙烯腈处理,丙烯腈会与肌苷发生反应,并可用于在称为肌苷化学擦除测序 (ICE-seq) 的方法中绘制A-to-I编辑位点。ICE-seq的灵敏度有限,而丙烯腈与假尿苷具有交叉反应性,因此降低了 ICE-seq 检测肌苷的特异性。为此,作者课题组探索了使用丙烯酰胺来靶向肌苷。使用丙烯酰胺荧光素试剂直接标记基序,与肌苷反应形成N1-荧光酰胺乙基肌苷 (FAE1I)。标记后,含有FAE1I的转录本可以使用抗荧光素抗体和磁珠进行亲和捕获(图 1)。 图1 丙烯酰胺荧光素标记肌苷 另外,作者课题组通过用炔基取代荧光素来进行化学标记,利用标记试剂 N-(4-乙炔基苯基)-丙烯酰胺(EPhAA)与肌苷反应形成加合物N1-乙炔基苯基氨基乙基肌苷 (EPhAE1I)。EPhAE1I 的炔基可以通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)与叠氮官能化荧光团或其他官能团缀合,从而对肌苷进行定量(图 2)。化学标记可以改进现有的分析流程,但对于大多数修饰而言,实现选择性反应仍然是一个挑战。正如作者对丙烯酰胺荧光蛋白和苯丙烯酰胺的实验所证明,丙烯酰胺能有效地标记肌苷,但其应用受到与假尿苷的交叉反应的限制。 图2 EPhAA标记肌苷 为了克服抗体和化学标记技术的固有局限性,研究人员向大自然寻求灵感,自然界已经进化出大量选择性识别和作用于RNA修饰的酶,利用这些天然存在的酶,可识别和绘制RNA编辑位点。利用RNA识别蛋白来识别编辑位点的一个例子是通过RNA免疫沉淀(RIP)。在该技术中,识别蛋白与特定修饰结合;抗体捕获该复合物后,通过实时荧光定量PCR或测序来检测RNA修饰。RIP利用了RNA结合蛋白的自然识别能力,但该方法仍然依赖于抗体。与之不同,氮杂免疫沉淀 (Aza-IP) 技术利用 m5C甲基转移酶(m5C-RMT)对m5C进行定位。在该工作中,细胞与胞苷类似物5-氮杂胞苷(5-aza-C)孵育。当m5C-RMT对5-aza-C进行甲基化时,m5C-RMT-RNA中间体被捕获。随后使用表位标签或抗m5C-RMT抗体富集。EndoV是一种天然存在的修复酶,在Mg2+作为辅因子时可切割含肌苷的底物。通过将辅因子从Mg2+改变为Ca2+,可调节EndoV活性,使其能够在不切割的情况下靶向结合肌苷修饰。该改变可有效地将EndoV从RNA切割酶转化为RNA结合酶。大肠杆菌EndoV(eEndoV),对单链RNA中的肌苷具有高度特异性。基于此,作者开发了核酸内切酶V免疫沉淀富集测序(EndoVIPER-seq):将细胞RNA片段化并进行乙二醛处理,以破坏RNA的二级结构;之后,将样品与eEndoV-MBP复合物一起孵育,以捕获含肌苷的转录物;最后使用抗MBP磁珠分离富集的转录物,去除乙二醛,并制备洗脱的RNA样品用于高通量测序(图3)。 图3 EndoVIPER-seq对肌苷进行定位 作者成功利用EndoV作为抗肌苷抗体后,开发了一种称为EndoV-linked immunosorbent assay(EndoVLISA)的分析方法。细胞mRNA经乙二醛化和生物素化后,缀合到链霉亲和素涂层的多孔板上(图4a)。然后用EndoV和具有报告酶的第二抗体进行肌苷的免疫检测,该报告酶提供化学发光信号以定量肌苷含量(图4)。 图4 EndoVLISA检测肌苷 随着核酸修饰的不断发现和大家对其功能理解的不断加深,开发识别和定位转录组中RNA修饰的方法的需求也越来越大。常用的依赖于抗体的方法有一定局限性:抗体不易获得,且通常具有非特异性。化学标记法可用于检测、富集和定量RNA修饰,但对于大多数修饰而言,实现选择性反应仍具挑战。自然界已经进化出大量选择性识别和作用于RNA修饰的酶,利用这些生物分子的亲和力为该领域提供了一个颇有前景的方向。 文章编号:74 原文链接: https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.accounts.2c00287 原文引用:
Ansley S. Felix; Alexandria L. Quillin; Shikufa Mousavi; Jennifer M. Heemstra*. Harnessing Nature’s Molecular Recognition Capabilities to Map and Study RNA Modifications. Acc. Chem. Res, 2022, 55: 2271-2279.
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