▲共同第一作者：吴霞博士&胡晶晶副教授
通讯作者：娄筱叮教授
通讯单位：中国地质大学（武汉）
论文DOI：10.1002/anie.202400766 （点击文末「阅读原文」直达链接）
本研究工作创新性地提出基于多肽的穿膜、识别及信号一体化的蛋白质通用型检测方法，实现了活细胞中多种细胞器蛋白质的定位定量分析。活细胞不同的功能细胞器中存在着丰富的蛋白质，一旦机体发生病变，相关蛋白质的表达或活性就会受到影响。因此，实现活细胞、特别是细胞器中的蛋白质分析对于开发重大疾病的诊断和治疗具有重要意义。目前，应用最广泛的蛋白质检测技术是基于抗体识别的，荧光标记抗体作为蛋白质检测的核心化学工具，主要依靠可变区的识别位点与蛋白质特异性结合，再通过抗体修饰的信号分子进行信号输出。然而，荧光抗体应用在活细胞中往往存在以下几个问题：（1）传统抗体的大分子难以穿过活细胞的细胞膜；（2）当抗体化学修饰过程位点不可控，可能导致抗体失活；（3）荧光标记的抗体结构在一定程度上缺乏通用性，当靶向不同的蛋白质靶点时，需要重新设计荧光标记的抗体，费时费力。因此，迫切需要开发一种新颖且简便的策略来进行活细胞的蛋白质检测分析。受荧光标记抗体生物结构的启发，近年来，娄筱叮教授团队致力于开发穿膜/识别/信号一体化多肽探针，在简化抗体的同时保留其特异性识别能力，以解决活细胞蛋白质分析中蛋白变化快、浓度差异大，难以精准测量的关键科学问题。在前期的工作中，娄筱叮教授团队已成功在穿模、识别及信号输出三个方面取得系列进展，其中包括1）设计合成具有穿过细胞膜屏障能力的多肽序列作为穿膜模块；2）选取抗体识别位点处的多肽序列，将其重构后作为识别模块；3）合成旋转受限导致荧光增强的信号分子作为信号输出模块。基于前期的研究基础，娄筱叮教授团队设想是否可以构建一种基于多肽偶联探针的通用检测平台，只需通过简单转换蛋白质识别单元或者细胞器靶向单元即可实现不同细胞器中多种蛋白质的分析检测。基于此设想，本课题在前期工作的基础上，整合转子型荧光分子支架、蛋白质识别序列、细胞穿膜模块及细胞器定位模块，建立了基于多肽偶联探针的模块化蛋白质通用检测方法（TP-TPE-TO），该通用检测平台集成了蛋白质识别单元和细胞膜穿透单元，优化了信号单元，特异性引入了细胞器靶向单元。可以通过识别和靶向单元的简单转换来实现不同细胞器中的蛋白质分析。如图1所示，该检测平台由三部分组成：a）以具有两个不同端基官能团的四苯乙烯（TPE）转子分子为核心单元。它不仅可以作为分别结合识别和靶向单元的分子支架，而且还可以作为信号输出分子；b）基于优化多肽序列TP的细胞穿透蛋白识别单元；c）基于小分子配体TO的亚细胞器靶向单元。当该多肽偶联探针被活细胞有效吸收后，可定位于特定的亚细胞器进行蛋白特异性识别，当不存在靶蛋白时探针处于自由旋转的溶解状态，不显示荧光；当靠近靶蛋白表面时，靶向肽与蛋白发生相互作用，限制探针的旋转从而释放荧光信号。为了验证该设计策略的可行性，本团队选取了三种典型细胞器中的六种蛋白质，包括内质网中的GRP78和GRP94，线粒体中的MAO A和Bcl-2，高尔基体中的COX-2和giantin。在活细胞中通过探针相关荧光信号的位置和强度，证明了多个探针的特异性和平台的通用性。该平台通过替换蛋白质识别序列和匹配细胞器靶向单元，实现了对细胞器内特定靶蛋白的检测，设计和合成简单，有望拓宽其应用范围，是活细胞内靶蛋白检测的一个里程碑。图1. 基于多肽偶联探针的细胞器蛋白成像通用型平台设计策略。(A)六个多肽偶联探针的结构。多肽偶联探针由三个单元组成：第一个单元是作为转子型荧光分子的TPE支架，用于信号输出；第二种是可细胞穿透的蛋白识别单元(TP)；第三种是亚细胞器靶向单元(TO)。(B)用于细胞器相关蛋白成像的六种多肽偶联探针示意图。(C) TP-GRP78-TPE-TO-ER 在内质网中检测GRP78的荧光信号增强示意图。以内质网相关GRP78蛋白为例，我们将GRP78靶向肽序列SNTRVAPRRRRC（TP-GRP78）和内质网特异性靶向的甲苯磺酰胺基团（TO-ER）偶联到作为转子型荧光分子的TPE支架上制备得到探针1（称为TP-GRP78-TPE-TO-ER）。为了评估该探针对GRP78的检测性能，我们首先选择在PBS缓冲液中进行了系列实验。如图2所示，该探针在溶液中对GRP78具有较好的特异性及选择性，随着GRP78浓度的增加，探针荧光具有显著的发射响应，并表现出良好的线性响应。该探针对GRP78的荧光响应强度远远强于其他干扰物，此外，荧光各向异性监测滴定实验显示该探针与GRP78的结合亲和力约为71.34 nM。图2. (A) TP-GRP78-TPE-TO-ER对不同浓度GRP78的荧光发射光谱；(B) 不同浓度GRP78孵育后的荧光发射光谱响应。插图:555 nm处荧光强度线性拟合图；(C) TP-GRP78-TPE-TO-ER对不同物质的荧光响应差异；(D) TP-GRP78-TPE-TO-ER的荧光各向异性监测。溶液中获得较为满意的结果后，我们进一步研究了该探针在活细胞中对内质网GRP78的响应反应。如图3A，共聚焦实验显示该探针成功定位于内质网，与商用的内质网染料具有较高的共定位系数(PCC：0.61)，远高于与线粒体和高尔基体的共定位系数。其荧光响应也是由GRP78特异性造成的，如图3B-D所示，在衣霉素预处理的细胞中检测到明显强于没有任何处理的对照细胞的探针荧光信号，这些上升的荧光信号归因于GRP78的过表达。此外，在没有mCherry标记的GRP78（mCherry-GRP78）表达的情况下，相应的探针处理的细胞未能产生显著的荧光信号。相比之下，当相同条件下在细胞中过表达mCherry-GRP78蛋白后， mCherry-GRP78荧光信号能与探针信号重叠且荧光强度明显增强（图3E-F）。这些结果为TP-GRP78-TPE-TO-ER与GRP78在活细胞内质网原位特异性成像提供了证据。图3. (A) TP-GRP78-TPE-TO-ER预孵育24 h后再加入商用内质网染料的HepG2细胞荧光共聚焦图像及相关共定位系数PCC；(B-C) 有或没有预孵育衣霉素HepG2细胞再加入TP-GRP78-TPE-TO-ER后的荧光共聚焦图像及强度；(D) HepG2细胞（有或没有预孵育衣霉素）的GRP78蛋白相对表达量；(E-F) 有或没有预孵育GRP78质粒的HepG2细胞分别加入TP-GRP78-TPE-TO-ER后的荧光共聚焦图像及强度。标尺:20 μm。受TP-GRP78-TPE-TO-ER成功检测内质网GRP78蛋白的鼓舞，我们进一步利用该平台设计五个新的多肽偶联探针，并研究它们是否可以点亮活细胞中其他细胞器的相关蛋白。首先，我们将附加到TPE支架上的基团（TP和TO）替换成对应蛋白的靶序列及细胞器靶向基团以获得相关探针。采用如上述类似的研究方法对这些探针进行了研究。令人惊喜的是，系列实验结果表明这些探针均能在溶液及活细胞中实现靶蛋白的高选择性和敏感性检测。最重要的是，这些观察证实了我们的假设，附加到TPE支架上的基团（TP和TO）赋予TP-GRP78-TPE-TO-ER在内质网中的定位并用于GRP78成像。最后，我们将6个探针分别对不同亚型肝癌细胞进行蛋白质检测分析，结果如图4所示，不同探针在不同亚型细胞中表现出不同程度的荧光，实验结果表明探针的共定位系数与荧光强度具有一定的相关性。如探针1的荧光信号及共定位系数在高转移型肝癌细胞系MHCC97H均比正常的肝细胞系THLE-2高，表明GRP78蛋白在MHCC97H中的表达量最高，该结果进一步被WB实验结果一致。此外，其他探针也实现了相应的细胞系中高表达蛋白质的检测。综上，利用该平台设计的探针（1-6）可成功实现内质网、线粒体及高尔基体相关靶蛋白的成像研究及不同亚型肝癌细胞系的区分。图4. (A)六个多肽偶联探针的结构；(B)活细胞中细胞器(ER、Mito、Golgi)及其对应的亚细胞蛋白示意图；(C-H)不同细胞系(THLE-2、Hep3B、HepG2和MHCC97H)的激光共聚焦图像及其相对荧光强度FI和共定位系数PCC；(I) 6个探针在C-H中的FI与PCC的相关性分析；(J) 6个探针在C-H中测得的荧光强度及共定位系数的聚类分析；(K) 6个探针的PCC值的对比热图。(L) COX-2、MAO A、GRP78、GRP94、giantin在不同细胞系中的WB结果。标尺:20 μm。我们设计了一个通用的以TPE为支架的活细胞细胞器内蛋白质检测平台，该平台以两个不同功能端基修饰的转子型分子为核心单元。通过简单地替换探针的蛋白质识别序列（TP）和细胞器靶向单元（TO），可以高灵敏度和高选择性地检测六种不同的蛋白质。当利用该平台设计的探针定位于相应的细胞器（如内质网、线粒体和高尔基体）并与靶蛋白结合后，转子型荧光分子旋转受限，导致荧光信号输出，报告相关蛋白质信息。为活细胞亚细胞器相关蛋白质分析检测建立了一种新颖的探针工具。基于此，本课题实现了内质网、线粒体及高尔基体三个亚细胞器相关的6种蛋白质的分析检测。同时，利用该6种蛋白在活细胞中的分析检测结果，可有效鉴别不同蛋白表达量的肝癌细胞亚型。娄筱叮，中国地质大学（武汉）教授，博士生导师，曾获国家优秀青年基金，国家重点研发计划纳米科技专项（青年项目首席科学家），青年拔尖人才项目，获Sci. China Chem.、Chem. Eur. J 新锐科学家，湖北省青年五四奖章，湖北化学化工学会优秀工作者，中国分析测试协会科学技术奖CAIA奖一等奖及获湖北省自然科学一等奖等。现主要致力于活细胞蛋白质分析检测研究，近五年以通讯作者在SCI收录期刊发表论文68篇，包括8篇Angew. Chem. Int. Ed.、3篇Adv. Mater.、7篇Anal. Chem.、1篇Acc. Chem. Res.、6篇ACS Nano、1篇Natl. Sci. Rev.、1篇CCS Chem.、1篇Adv. Sci.、4篇Biomaterials等，全部论文引用9035余次，H指数56，15篇论文入选ESI 1%高被引论文，1篇入选高热点论文。主持省部级及以上科研项目9项，获得国家授权发明专利7项，参编专著4部。
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