分享一篇Chemical Science上的文章，本文的通讯作者来自法国斯特拉斯堡大学（Universit´e de Strasbourg）的Iuliia A. Karpenko Andrey S. Klymchenko和 Dominique Bonnet教授。Dominique Bonnet教授的课题的研究方向是设计GPCR相关的分子探针，以更好地了解生命的复杂性并开辟新的治疗途径。
G蛋白偶联受体（GPCR）是人类最大的跨膜受体家族。GPCR涉及健康和疾病中人类生理学的所有方面。GPCR家族的每个成员都有独特的组织依赖性表达和定位模式，这对于发挥其生理和生理病理作用至关重要。因此，在细胞以及生物水平上对GPCR的表达进行成像，对了解GPCR的表达水平与疾病的关系至关重要。与基于放射性同位素的探针相比，荧光的造影剂是非电离辐射并具有更长的保存期限。尽管荧光探针很容易用于研究活细胞中的GPCR，但对于整个动物受体的荧光成像，仍处于起步阶段。目前尚未在小鼠中报道内源性GPCR荧光成像的例子，这主要是由于许多内源性GPCR的表达水平较低以及缺乏合适的荧光探针所致。 理想地，用于内源性GPCR的体内成像的荧光探针应满足以下要求：（1）对靶标具有高亲和力和选择性；（2）探针在近红外（NIR）区域的吸收和发射，该区域是使组织和血液中的光散射和吸收最小化，同时增强组织穿透力的光学窗口。（3）具有荧光特性，可在与目标受体结合后，“打开”其荧光，以确保较高的信噪比。在这之前，作者报道了具有环境敏感性折叠功能的荧光方酸二聚体的概念，可以在免洗条件下实现可视化信噪比高的活细胞中GPCR。在水性介质中，H聚集类型的二聚体的形成导致探针完全荧光猝灭。相反，一旦与受体结合，荧光团就暴露于生物膜的疏水环境中，这导致二聚体的解离和荧光的恢复。然而该方法是在远红外区域显示吸收和发射，无法实现活体成像。基于二聚体概念，本文作者开发了一种具有前所未有亮度的近红外荧光（NIR）二聚体探针，首次实现了在活体小鼠中无背景检测内源性GPCR——催产素受体（OTR）。
用于OTR的NIR荧光二聚体探针设计的关键要素是荧光团的选择。除了在NIR窗口（700-950 nm）中操作外，荧光团还应该是明亮的，光稳定的并且具有足够的水溶性。因此，作者设计了PEG-8链修饰的花菁素衍生物Cy5.5，目的是补偿染料的亲脂性并避免非特异性互动，最终成功地实现了NIR单聚体mCy5.5-PEG和二聚体dCy5.5-PEG探针的合成。
为了表征由NIR花菁二聚化产生的荧光性，作者在不同极性的溶剂中评估了二聚体dCy5.5-PEG和单体mCy5.5-PEG的吸收和荧光性质。在将MeOH添加至水中后，dCy5.5-PEG中的分子内H聚集体迅速消失，这导致最大吸收移至682 nm，同时恢复了荧光。因此，dCy5.5-PEG具有出色的荧光性质，在有机溶剂中的QY比在水中高出140倍。而单体mCy5.5-PEG的特征在于水和有机溶剂之间的QY差异仅小于2.7倍。
同时，作者将dCy5.5-PEG嫁接到靶向OTR的配体（CBT）上，成功合成了dCy5.5-PEG-CBT，及其对应的单体mCy5.5-PEG-CBT。之后，作者测试了NIR荧光二聚体dCy5.5-PEG-CBT检测活细胞中OTR的能力，在免洗条件下对过表达与GFP融合的OTR的HEK 293细胞进行了共聚焦显微镜实验。在低至10 nM的dCy5.5-PEG-CBT便可以实现对于细胞膜的OTR的成像。在大量未标记的CBT配体的存在下进行的竞争实验未显示任何荧光膜染色，表明dCy5.5-PEG-CBT与细胞膜之间没有非特异性相互作用，并且与OTR特异性结合。过量的未结合的非荧光mCy5.5-PEG-CBT在水溶液中具有很高的荧光强度，产生了很强的背景。即使dCy5.5-PEG-CBT的浓度达到 500 nM的浓度，也无需进行清洗，便可以实现成像。
最后，作者使用新探针在哺乳期小鼠模型上观察内源的OTR表达。通过尾静脉注射将dCy5.5-PEG-CBT注射到小鼠体内。30分钟后，在小型动物活体成像系统中成像，可以发现，在幼稚的小鼠中只有在肝脏位置产生了标记，而观察不到乳腺标记。这可能是由于在这个阶段，小鼠在腺体区域并不会产生催产素GPCR。而使用单体探针mCy5.5-PEG-CBT则会产生强烈的脱靶荧光。这些结果突出了使用荧光二聚体探针增加体内成像信噪比的优势。
总之，基于具有环境敏感性折叠功能的荧光二聚体的概念，作者开发了一种明亮的荧光NIR探针，可以对活体小鼠的内源OTR进行特异性，无背景的成像。
本文作者：LSC
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2020/sc/d0sc01018a
原文引用：DOI: 10.1039/d0sc01018a
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