分享一篇JACS上的文章，文章的通讯作者是来自约克大学的Gideon J. Davies和莱顿大学的Herman S. Overkleeft两位教授，前者主要从事糖化学合成与降解相关蛋白质的结构酶学和化学生物学研究，后者主要从事糖生物学与免疫学相关的化学探针设计合成与应用研究。
高尔基体α-甘露糖苷酶II （Golgiα-mannosidase II，GMII）是一种糖苷水解酶，它能够催化N-聚糖GlcNAcMan5GlcNAc2的末端α-1,3-和1,6-甘露糖的顺序水解产生GlcNAcMan3GlcNAc2，这是形成复杂的N-聚糖的重要步骤。N-聚糖支链的改变直接与细胞转移能力相关，因此GMII是潜在的抗癌靶标，GMII抑制剂也被认为是潜在的抗癌药物。GMII采用两步双置换机制，其中共价酶中间体的侧链是氧碳鎓离子样的过渡态，由于该中间体是cyclophellitol类抑制剂的理想靶标，所以作者认为此类化合物可以作为创建基于活性的糖苷酶探针warheads，用于抑制剂的高通量筛选、药物发现、生物量酶profiling和结构解析。
为了寻找新的GMII抑制剂，作者首先基于cyclophellitol类活性探针骨架，合成了环氧化物和氮丙啶类化合物（manno-epi-cyclophellitol epoxide and aziridine），并且通过活性测试、速率常数等试验发现二者对GMII均具有典型的时间依赖性抑制，其中氮丙啶类具有比环氧化物高~100倍的抑制作用。此外，作者还解析了aziridine类抑制剂和GMII的晶体结构。于是作者便选择了以氮丙啶化合物作为支架，合成了一系列基于活性的探针，包括Cy5-alkyne、biotin-alkyne、5’/6’-TAMRA-PEG4-alkyne等。为了确定所合成的探针能够与甘露糖苷酶反应，通过荧光胶内扫描验证了cyclophellitol aziridine probes与5种单克隆和细胞表达的GH38 α-甘露糖苷酶（hEpman，hGMII， hLAM，hMan2A2，hMan2C1）的结合能力，并且在小鼠不同组织中也能够实现标记。
GH38 α-甘露糖苷酶的成功检测以及竞争性抑制剂阻断探针修饰的能力提示使用荧光偏振（FluoPol）ABPP分析法对抑制剂进行高通量筛选是可行的。于是作者利用带较长荧光寿命的TAMRA基团的探针，通过在96孔板中的高通量荧光偏振ABPP扫描的方法从358种亚氨基糖化合物库（包括具有各种构型和N-烷基化的吡咯烷和哌啶亚氨基糖）中筛选出了7个尚未鉴定过的GMII抑制剂，表征了这几个抑制剂的IC50和Ki值，并且成功解析了与甘露糖苷酶相结合的晶体结构。
综上所述，这项工作利用已知的GH38 α-甘露糖苷酶抑制剂Manno-epi-cyclophellitols作为支架并将其设计成为环氧类和氮丙啶类基于活性的探针，通过荧光偏振的高通量筛选方法，鉴定出新的竞争性酶抑制剂，为未来选择性GMII抑制剂的开发奠定了基础。
本文作者：MB
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c03880
原文引用：10.1021/jacs.0c03880
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