分享一篇2023年2月发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为“A Small-Molecule Fluorescence Probe for Nuclear ATP”。文章的通讯作者为韩国浦项科技大学的Kyo Han Ahn教授。

ATP是生物分子合成和降解、膜转运和肌肉收缩等细胞过程的主要能量来源，也作为细胞内或细胞外的信号分子，用于器官发育，细胞运动，神经传递等。在细胞器中，与ATP相关的生物过程已经使用荧光素酶的生物发光方法进行了研究。然而，这种方法有很多局限性，一方面测量过程消耗ATP，改变了其中的ATP水平，另一方面，测量依赖于荧光素酶浓度。为了克服这些局限性，基于基因编码荧光共振能量转移(FRET)的荧光方法被设计出来，通过ATP结合引起的融合蛋白构象变化导致生物传感器的荧光变化，用来观察细胞ATP/ADP浓度比的变化。然而，构建这些生物传感器需要复杂的技术，如蛋白质纯化、基因工程和生物偶联等。因此，可逆结合ATP的小分子探针的研究受到广泛关注，通过引入适当的细胞器靶向部分，可以选择性地检测相应细胞器中的ATP(图1)。由于不清楚具体的细胞核靶向部分，开发一种检测细胞核ATP的小分子荧光探针仍然是一个挑战。

此前，作者报道了一种含双(二甲基吡啶胺)(DPA)的荧光团锌离子配合物，用于螯合Zn^II，即1-Zn^II。它与ATP/ADP的结合相互作用诱导荧光团的分子内电荷转移(ICT)，导致荧光信号开启。在进一步探索传感策略的过程中，作者研究了基于苯香豆素的锌离子配合物，并意外发现其中NucATP可用于检测细胞核ATP。这种检测细胞核ATP的小分子荧光探针对于研究核内ATP相关的生物过程具有很大的潜力，作者对其传感特性进行了详细的研究。

作者用苯香豆素(BC)染料引入DPA，得到相应的配体(L1)，与Zn(II)螯合得到NucATP。NucATP在pH7.4的HEPES缓冲液中几乎没有荧光，在ATP存在的情况下，NucATP表现出强烈的荧光，实现了ATP的开关式响应。在pH 7.4的HEPES缓冲液中用ATP处理，NucATP在400 nm激发时，在595 nm处荧光最强(图2A)。ATP检测过程是可逆的，在加入apyrase后，酶催化未结合的ATP水解，荧光的NucATP - ATP的数量减少，而非荧光的NucATP的数量增加，荧光强度逐渐降低(图2B)。在0 ~ 100 μM ATP浓度范围内，荧光滴定NucATP (10 μM)的线性响应可达70 μM [ATP](图2C, D)。当10 μM NucATP在25°C的缓冲液中用50 μM ATP处理时，在几分钟内就达到信号饱和(图2E)。NucATP在pH 7.0~8.0的pH范围内响应最好。随着溶液变酸，荧光强度降低，这可能是由于ATP的质子化，削弱了其与Zn(II)配合物的结合，NucATP及其ATP配合物具有良好的光稳定性，在365 nm (90 W UV灯)连续照射1小时后，其荧光强度也几乎没有下降。作者评估了NucATP与各种生命活动相关物质如金属离子、阴离子、生物硫醇和活性氧以及核苷酸的荧光响应，在加入ATP和ADP后，NucATP的荧光强度分别增加了25倍和16倍，而加入其他物质后，荧光强度没有明显增加(图2F)。当用几种RNA和DNA处理NucATP时，荧光增强也可以忽略不计(图2G)。

接下来作者用NucATP与各种商业细胞器染料进行共定位，通过PC3细胞系的荧光成像评估NucATP在细胞内的分布。NucATP仅与细胞核染料Nuclear-ID Red提供了良好的重叠图像，Pearson共定位系数较高(PCC = 0.89)(图3A, 3B)，作者监测活细胞中细胞核ATP水平的变化，鉴于NucATP具有良好生物相容性且选择性定位于细胞核检测ATP，用NucATP处理的PC3细胞在细胞核中显示出强烈的荧光，可能是由于与ATP的结合相互作用(图3C)。作者加入聚(ADP -核糖)聚合酶(PARP)时，PARP可以产生ATP或ATP前体物质葡萄糖，细胞核ATP水平升高，荧光强度增加。PC3细胞进一步用KCN处理后，KCN抑制ATP合成过程中的氧化磷酸化(OXPHOS)，细胞核ATP水平降低，荧光强度下降(图3D)。

基于细胞成像结果，作者应用NucATP来区分肿瘤细胞和正常细胞。与正常细胞相比，肿瘤细胞具有更高的ATP水平，反映了肿瘤细胞中具有更高增殖水平。作者对五种肿瘤细胞系和三种正常细胞系，用NucATP (5.0 μM)在37℃下孵育30 min。与正常细胞系相比，所有肿瘤细胞系显示出2.1 ~3.3倍高的ATP水平(图4A)。鉴于NucATP能够定量比较几种正常细胞和肿瘤细胞之间的ATP水平，接下来，作者通过TPM比较了肿瘤组织和正常组织之间的ATP水平。为了比较肿瘤组织和正常组织中的ATP水平，我们收集了正常小鼠和肿瘤小鼠模型的十个器官的组织样本。分别用NucATP (5.0 μM)在pH 7.4 PBS (10 mM)中处理30分钟，比较产生的荧光强度代表ATP水平，肿瘤小鼠组织中的ATP水平始终高于正常组织中的ATP水平(图4B, C)，肿瘤小鼠器官的ATP水平始终高于正常器官(图4D)。因此，可以通过细胞核ATP的荧光强度不同来区分肿瘤组织与正常组织。

与正常细胞和器官组织相比，肿瘤细胞和器官组织的细胞核ATP水平较高，可能是肿瘤细胞和器官组织的细胞增殖速度加快所致。基于此，作者进一步研究了肿瘤细胞和正常细胞系之间依赖细胞周期的ATP水平变化(图5A)。在与DNA染料Hoechst 33342和NucATP共孵育后，进行流式细胞术分析以测定前列腺肿瘤细胞PC3分裂时的ATP水平(图5B)。结果表明，ATP水平随细胞周期的不同而显著不同。例如，G0/G1期的细胞数量比G2/M期丰富得多(图5C)，相反，G2/M期的ATP水平远高于G0/G1期(图5D)。结果表明有丝分裂需要相当高水平的ATP参与。根据细胞周期阶段计算总ATP和DNA水平，由于细胞数量的偏差，差异并不大(图5E)。肿瘤细胞(PC3)的ATP水平高于正常细胞(PNT2)，并按G0/G1、S、G2/M阶段依次升高(图5F)。实验结果表明，肿瘤细胞细胞内ATP水平高于正常细胞。

综上所述，作者开发了能在pH 7.4条件下以25倍荧光增强感知细胞核ATP的小分子探针NucATP，NucATP基于苯香豆素染料Zn(II)配合物，可以与ATP可逆且快速结合，其配位模式改变导致荧光开关变化。探针对ATP表现出优异的选择性，可以用来监测细胞和组织中的细胞核ATP。作者使用探针比较了几种正常细胞和肿瘤细胞，揭示后者的细胞核ATP水平要更高。此外，作者比较了正常小鼠和肿瘤小鼠各器官的细胞核ATP水平，发现肿瘤组织的核ATP水平高出3.9 - 7.8倍。肿瘤组织中明显高水平的细胞核ATP可以解释为恶性肿瘤增殖，通过细胞周期依赖的荧光分析观察到有丝分裂阶段高水平的细胞核ATP。因此，NucATP在研究细胞核ATP相关生物过程和区分肿瘤组织与正常组织方面具有巨大潜力。