分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.杂志发表题为Fluorescence-Based Detection of Fatty Acid β-Oxidation in Cells and Tissues Using Quinone Methide-Releasing Probes的研究论文，文章的通讯作者为自九州大学的Akio Ojida教授。
细胞代谢是基本的生物学过程，在维持体内稳态方面发挥着核心作用。其中脂肪酸β-氧化（FAO）是脂质分解代谢的关键过程，通过四种酶促反应将脂肪酸链重复降解为乙酰辅酶A。中至长链脂肪酸(C8 - C18)主要在线粒体中分解代谢，而超长链脂肪酸(超过C22)在过氧化物酶体中进行β氧化。已知FAO代谢异常与许多疾病状态有关，如癌症、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等有关，因此检测代谢活性的变化对于理解疾病的发生和发展至关重要。目前已经开发出了用于检测脂肪酸β-氧化代谢活性的荧光探针，该探针含有脂肪酸结构单元，将其作为FAO的荧光底物，它可以释放可以发出荧光的7-羟基香豆素，虽然该探针已成功用于检测活细胞中的FAO活性，但由于香豆素荧光团的发射波长短和荧光强度弱，同时释放的7-羟基香豆素会发生泄漏，在长期延时成像过程中受到限制。为了克服这些限制并扩大这种基于荧光的代谢分析的实用性，作者引入了一种新的化学探针，可以检测活细胞中FAO的活性。该探针基于FAO触发的活性醌甲基(QM)的形成，能够使用多种分析技术检测细胞中的FAO活性，包括荧光成像、凝胶内荧光活性蛋白谱分析(ABPP)和荧光激活细胞分选(FACS)。该探针不仅能检测培养细胞中的FAO活性，还能检测小鼠肝组织中的FAO活性。首先，我们初步合成了qm释放探针1-3，用于检测活细胞中FAO的活性。这些探针具有一个苯环取代壬酸烷氧基(C9)和α-氟乙酰胺在对位(图2a)。在探针2和3中，在苯环中引入氟来调节探针的水稳定性以及生成的QM的亲电反应性(图2a)。探针3 (5 μM)与肝癌HepG2细胞孵育指定时间(6 h)，将培养液和细胞裂解液混合在铜催化叠氮化物-烷基环加成(CuAAC)条件下与香豆素-叠氮化物结合，用LC-MS检测代谢产物。如图2b所示，新的峰出现，且强度随时间逐渐增加。LC-MS分析显示，这些峰对应于探针3与截断的(C3, C5或C7)脂肪酸的代谢产物(图2b中的峰b, c和eg)。值得注意的是，苯酚衍生物5在苯基位置上有一个羟基(图2b中的峰d)。当用依托莫西预处理细胞时，代谢产物的峰值几乎消失，依托莫西是一种典型的FAO抑制剂，通过与肉毒碱棕榈酰转移酶I (CPT1)共价结合，强烈阻止脂肪酸进入线粒体。这些结果表明探针3在活细胞中通过FAO代谢产生QM。图2. FAO介导的HepG2细胞探针3降解的HPLC分析使用探针1-3利用凝胶内荧光活性蛋白分析(ABPP)检测活细胞中的FAO活性。用1-3 (5 μM)探针在无血清DMEM中处理HepG2细胞14 h，细胞裂解液经TAMRA -叠氮化物CuAAC处理，检测探针产生的QM标记的蛋白。凝胶内荧光分析显示，在较宽的分子量范围内存在大量与所标记蛋白相对应的荧光条带，且条带强度随孵育时间的增加而逐渐增加(图3a)。定量带强度分析显示探针3对蛋白的标记效率最高(图3b)。当细胞经依托莫西预处理后，荧光带几乎消失(图3d)。图3. HepG2细胞qm标记蛋白的ABPP分析。接下来进行了化学蛋白质组学分析，以了解QM对细胞蛋白的反应性。制备蛋白质组学样品时，用探针3 (1 μM)孵育HepG2细胞1 h，标记的蛋白通过CuAAC反应与去硫代生物素叠氮化物偶联。使用亲和蛋白珠进行亲和分离后，分离的蛋白被蛋白酶消化，并进行无标记LC-MS/MS分析(图4a)。总共鉴定出883种蛋白质(log2(3/DMSO)比值> 2)，包括一些参与FAO途径的线粒体酶。然而，数据表明，探针3产生的QM与整个细胞中发现的蛋白质发生反应。根据UniProt数据库，发现富集蛋白的亚细胞分布为62%的细胞质和/或细胞核(图4b)，其次是线粒体(12%)和ER(6.3%)蛋白。蛋白质组学分析还表明，凝胶内荧光ABPP分析中在15 kDa处观察到的强荧光带可能归因于细胞质蛋白，如硫氧还蛋白、胱抑素和/或核糖体蛋白。接下来作者用探针3孵育活细胞，用4%多聚甲醛固定后与叠氮化的荧光分子进行CuAAC反应，结果显示具有明亮的荧光；当用FAO抑制剂预处理细胞后，荧光信号几乎消失(图5a)。作者还使用该探针检测了小鼠肝脏中的FAO活性，腹腔注射探针的小鼠其肝脏观察到明亮荧光，而FAO抑制剂处理的小鼠荧光细胞消失(图5b)。通过FACS分析进一步研究贝扎贝特对肝细胞的影响。数据显示，从小鼠肝脏分离的肝细胞经探针3处理后显示出明显的荧光增强，经贝扎贝特预处理后荧光增强进一步增强(图5c)。图5. 探针3对HepG2细胞和小鼠肝细胞FAO活性的荧光分析。综上所述，作者开发了一种新的化学探针3，用于荧光检测细胞中FAO的活性。基于FAO触发的QM释放和共价锚定，然后与荧光团进行生物正交偶联，探针3能够在各种荧光分析中以合适的波长检测细胞中的FAO活性。探针3在检测小鼠肝细胞中FAO活性中进一步证明了其实用性。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c02043
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