为大家分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章“NHS-Ester Tandem Labeling in One Pot Enables 48-Plex Quantitative Proteomics”。本文的通讯作者是麦克马斯特大学的Yu Lu教授。
稳定同位素标记策略被广泛应用于多重定量蛋白质组学。结合同位素质量差标记和同重元素(isobaric)标记的混合同位素标记策略可以极大地提高样品的多重性。在这项工作中，作者提出了一种新的串联标记方法，被称之为一锅法NHS酯串联标记 (NHS-ester tandem labeling in one pot, NETLOP)。为了制备用于超多重 MS1-MS2杂交定量蛋白质组学的多肽样品，作者的策略是用不同的同位素和等重同位素试剂分别标记多肽N端和赖氨酸残基的氨基，进行正交的MS1和MS2水平定量。到目前为止，商业上可用的同位素和等重同位素的伯胺基标记试剂主要是基于NHS酯的，因为这些试剂与伯胺基反应效率高，特异性强。因此，作者决定在NETLOP工作流程的两个步骤中使用商用的NHS酯基标记试剂，即三重mTRAQ试剂和16重TMTpro试剂。这两种试剂都具有最高的可能的多重性，并且很容易被推广到全世界的每一个蛋白质组学和蛋白质化学实验室中使用。
具体来说，作者用含稳定同位素的mTRAQ试剂标记肽的N端，用等重同位素的TMTpro试剂标记赖氨酸残基。通过这种方式，无论胰蛋白酶切割是否完整，最终的多肽总是在MS1水平形成三对(Δ0，Δ4，Δ8)，这简化了后续的数据依赖采集(DDA) MS2方法的建立和数据分析。作者首先优化了16重TMTpro等重标记赖氨酸残基，由于在有限的NHS酯试剂用量下，较高的pH值可以提高赖氨酸残基的标记特异性，作者通过优化TMTpro试剂的量及反应pH实现了TMTpro试剂在赖氨酸上的特异性标记。作者接着优化了2或3重同位素mTRAQ标记多肽N末端。由于在NETLOP工作流程中，NHS酯反应是在单个试管中对每个样品进行的，因此在使用羟胺或任何其他含有游离氨基的化学物质进行赖氨酸特异性标记的第一步后，淬灭TMTpro试剂是不可行的。因此，作者决定将第一次TMTpro标记反应放置较长时间(4 h)，并在孵育后确认TMTpro试剂失活。
然后，作者通过标记HeLa细胞样本，并在单个LC-MS/MS实验中进行32重和48重定量蛋白质组学验证，证明了NETLOP方法的实用性。与目前的混合同位素标记方法相比， NETLOP方法不需要在不同标记步骤之间的样品处理，以最大限度地减少样品损失，不会导致保留时间偏移，从而影响定量准确性，可以与其他NHS酯同位素标记试剂联用以进一步增加多重性，并且与各种来源的样品兼容从而具有广泛的生物和临床蛋白质组学应用前景。
本文作者：WQW
责任编辑：LYP
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c01314
文章引用：DOI：10.1021/acs.analchem.1c01314
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